黄渤海放线菌多样性的研究及一株南极放线菌新种的分类鉴定

【摘要】黄渤海地处中国暖温带，其自然资源和生物资源都非常丰富，与人类生产及生活密切相关。目前对黄渤海的海洋生态系统中的海洋放线菌种群、数量及多样性知之甚少，因此非常有必要对这一海域的放线菌进行多样性研究，这对于后期纯培养菌株的分离、我国药用微生物资源的开发具有重要的意义。采用免培养技术分析了黄渤海环境中放线菌的多样性，对来自黄海和渤海的四个位点的沉积物样品构建16SrDNA克隆文库。16SrDNA序列的测序结果表明，渤海B42-2位点获得的放线菌类群最多，分布于放线菌门的17个属中；黄海H42-3位点次之，得到16个放线菌属；渤海四个位点提取DNA混合的样品获得到15个放线菌属；黄海四个位点提取DNA混合的样品获得的放线菌类群最少，但也得到13个放线菌属。综合四个位点分析，黄海和渤海环境中的放线菌资源非常丰富，多样性高，多数分布于酸微菌纲（Acidimicrobineae）和放线菌纲（Actinobacteridae）中，少数分布于腈基降解菌纲（Nitriliruptoria）和嗜热油菌纲（Thermoleophilia）中，分属于13个目，25个科，共32个属。将不同分类单元代表序列与最大已知同源性序列构建N-J系统发育进化树，发现很多序列形成独立的分支，与已知的同源性最大的菌株序列遗传距离较远，表明黄渤海环境中拥有独特的放线菌类群，蕴藏大量的新种资源。采用常规培养方法并利用15种不同的培养基对黄海6个位点和渤海12个位点的海泥样品进行放线菌的分离纯化，获得119株放线菌，根据菌株形态初步排重，选取代表菌株进行16SrDNA全长序列测定并进行Blast比对，结果显示这些菌株分别属于放线菌的10个属25个不同种，除此之外，采用48孔板富集方法对黄渤海4个位点的海泥样品进行分离纯化，得到7株菌株，分属于链霉菌属和拟诺卡氏菌属。这些结果进一步表明黄渤海沉积物放线菌多样性极为丰富。将黄海和渤海分离到的菌株序列与最大同源性序列比对，分别构建N-J系统发育进化树，发现发育树结构复杂，分支较多，黄渤海沉积物放线菌菌群结构与陆地环境不同，多样性丰富，蕴藏大量的新种资源。对从黄渤海分离到的25株放线菌菌株合成活性次级代谢物的潜力进行了分析。分别采用三对兼并引物对其进行I型聚酮合酶（PKS-I）、II型聚酮合酶（PKS-II）和非核糖体肽合成酶（NRPS）功能基因的筛选。分析结果发现，有9株放线菌含有I型聚酮合酶基因，有15株放线菌含有II型聚酮合酶基因，有7株菌含有非核糖体肽合成酶基因。将这些菌株的功能基因序列翻译成氨基酸序列，与GeneBank中已知化合物基因的氨基酸序列进行比对，部分菌株与已知化合物基因的氨基酸序列的最大同源性较低，预示了这些菌株中具有合成结构新颖的化合物的潜力。从南极长城站土样中分离纯化得到的菌株GW9-2T，革兰氏阳性，有孢子结构，呈球状，可以形成长的孢子链，表面粗糙。与已知序列16SrDNA序列进行同源性比对，菌株GW9-2T与拟诺卡氏菌属序列相似度最高的是菌株NocardiopsislucentensisDSM44048T、NocardiopsisflavescensSA6T、NocardiopsisalbaDSM43377T和NocardiopsishalotoleransDSM44410T这四株菌。DNA-DNA杂交结果显示，菌株GW9-2T与这四株菌的亲缘值均不超过40%。菌株GW9-2T（G+C）mol%含量为76.8%；全细胞主要糖组分为无特征性糖，胞壁肽聚糖包含的氨基酸为meso-DAP；主要磷脂类脂成分有PG、PC、PME和PE；主要脂肪酸有iso-C16:0（19.3%）、anteiso-C17:0（12.7%）、ω9c-C18:1(9.3%)、iso-C15:0(8.3%)和iso-C17:0(8.3%)；主要甲基萘醌是MK-9(H4)(31%)。以上数据结合16SrDNA序列同源性比对结果，确定菌株GW9-2T（=DSM45699T=NRRLB-24873T=CGMCC4.7023T）为拟诺卡式菌属的一个新种，命名为Nocardiopsisfildesensissp.nov.。
【作者】许姗姗；
【导师】李静；
【作者基本信息】中国海洋大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】黄渤海沉积物；放线菌；免培养；纯培养；多样性；功能基因；

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