皂角苷佐剂对大菱鲆重要免疫基因表达及非特异免疫的影响

【摘要】细菌性疾病是威胁水产养殖鱼类健康的主要原因之一。长期以来，采用化学制剂和抗生素类药物治疗鱼病，不仅病原菌耐药性增强，还会使鱼体药物残留而对人类造成间接地伤害。鱼类疾病控制正在向用鱼用疫苗放置方向发展。鱼病的疫苗免疫防治技术是最佳的鱼病防治策略，但鱼类的特殊生活环境，注射和口服免疫接种的方式都不是最优途径，浸泡则成为鱼用疫苗的首选。为了增强浸泡疫苗的免疫保护效果，本研究以前期筛选出的皂角苷为佐剂，以甲醛灭活鳗弧菌疫苗，以大菱鲆为实验鱼类，从鱼类非特异性免疫和特异性免疫两个方面，对皂角苷的佐剂功能进行评价，以期从分子水平上阐明皂角苷佐剂的免疫机理。第一部分，以不同浓度的皂角苷（15mg/L、35mg/L）为佐剂，用灭活鳗弧菌为浸泡疫苗免疫大菱鲆，采用腹腔注射为阳性对照组，对免疫后不同时间段内各主要免疫器官（皮肤、鳃、头肾、脾脏和肠组织）中各主要免疫相关基因的表达量进行了定量分析。结果表明，在两组皂角苷佐剂联合浸泡疫苗组的大菱鲆的鳃组织中，MHCⅡα基因在浸泡的4~8h内，即表现出显著的表达，相对表达量分别为136.3和378.5，1d后表达量迅速降低。高浓度的皂角苷组及皂角苷联合疫苗浸泡组在浸泡8h时的大菱鲆皮肤中，MHCⅡα基因的相对表达量即可出现显著提高，相对表达量47.1和41.9，3~15d内，皮肤中MHCⅡα基因的相对表达量最高的一组出现在低浓度皂角苷（15mg/L）联合疫苗浸泡组，表达量为57.6。浸泡1d后，脾脏中MHCⅡα基因相对表达最高的组出现在注射对照组中，且该基因的高相对表达量在脾脏持续至15d。在脾脏中，浸泡3d~15d内低浓度皂角苷联合疫苗浸泡组的MHCⅡα基因呈现次高相对表达量，仅次于注射组，显著高于其他各组（P<0.05），在头肾中，浸泡后的第3d，两组皂角苷联合疫苗浸泡组的MHCⅡα基因呈现高相对表达量，两组表达差异不显著（P>0.05）。而在注射组中，头肾的MHCⅡα基因表达从浸泡后的第3d开始，到第15d时呈现最高值，相对表达量分别到达6.37，显著高于其他各组（P<0.05）。对IL-1β基因在皮肤、鳃、头肾、脾脏和肠中的表达分析结果显示，皮肤中IL-1β表达的最高值，出现在佐剂联合疫苗组，其中低浓度组（15mg/L）比高浓度组（35mg/L）的表达高，二者显著高于其他组（P<0.05）,相对表达量分别为14.01和11.02。IL-1β与MHCⅡα在皮肤中的表达趋势相同，鳃中IL-1β表达的最高值，同样出现在佐剂联合浸泡疫苗组，分别达到21.58和32.58，且显著高于其他各组（P<0.05）。头肾和脾脏组IL-1β表达的最高值都出现在4h的注射组，表达量分别是169.53和222.1，显著高于其他各组（P<0.05）。头肾和脾脏两个组织中，佐剂联合疫苗组表达优于其他各组，但差异不显著（P>0.05）。肠中IL-1β的的表达的最高值仍然出现在注射组，表达量为24.51，次高组为高浓度佐剂联合浸泡疫苗组，表达量达到20.02。TNF-α在皮肤中的表达高峰出现在7d的低浓度佐剂加疫苗组，其他各组差异不显著。鳃中的表达量最高出现在7d注射组，同时间佐剂加疫苗组的表达是次高值。佐剂加疫苗组的肠中TNF-α的表达在8h时出现明显上调，显著高于其他各组，而15d的注射组才开始上调。脾脏中TNF-α表达只有注射组在7d时显著升高是其他各组的近百倍。头肾中的最高值出现在单佐剂组，而注射组在整个事件段都显示出明显优势。对大菱鲆背腹面不同分区的皮肤进行三种基因表达分析表明，MHCⅡα基因表达量最高的出现在鳃盖下方皮肤，达到6.56。其次是尾部侧线达到6.31，腹面抗原呈递效果不明显。IL-1β和TNF-α基因的表达趋势与MHCⅡα的相同。结果表明，皂角苷联合鳗弧菌疫苗浸泡免疫大菱鲆后，可以显著提高疫苗抗原在皮肤等组织中呈递，同时引发相应组织的炎症反应。本文第二部分评价了皂角苷增强鱼类非特异免疫效果，分别用浓度为0、15和35mg/L的皂角苷浸泡大菱鲆，分析了浸泡后6、12、24、48和72h时大菱鲆白细胞的吞噬活力、血清补体旁路途径溶血活性、血清与黏液中溶菌酶活性、抑菌活性与碱性磷酸酶活性及血清总蛋白浓度。结果显示，皂角苷低浓度组（15mg/L）与高浓度组（35mg/L）大菱鲆白细胞吞噬活力分别在浸泡后12h与24h出现显著的增高（P<0.05）。实验组大菱鲆血清中补体旁路途径溶血活性除低浓度组在12h与24h较对照组低外，其他检测时段均高于对照组（P<0.05）。血清溶菌酶活性最高值出现在低浓度组浸泡后6h时，黏液中未能检测出。不同时间点各组大菱鲆黏液抑菌活力变化幅度较大，两实验组黏液抑菌活力在浸泡后6h与12h时较对照组提高，两个实验组间无差异（P>0.05）。血清中AKP活力高峰值出现在浸泡后6h与12h，该时段AKP的活力显著高于对照组，且实验组间存在差异（P<0.05），而黏液中AKP高峰值出现在12h，该时段AKP的活力显著高于对照组（P<0.05），实验组间无差异。浸泡皂角苷后6h高浓度组血清中蛋白浓度达到最高值，除12h时各组差异不显著外（P>0.05），24h~72h高浓度组中血清蛋白含量均高于低浓度及对照组（P<0.05）。结果表明皂角苷具有提高鱼类非特异免疫水平的效果，结果为皂角苷的佐剂应用提供了理论的支持。
【作者】韩雯；
【导师】王秀华；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，硕士
【关键词】皂角苷；白细胞吞噬；补体激活活力；AKP；MHC；IL-1β；TNF-α；

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