壳聚糖衍生物对蒸发过强型大鼠干眼症缓解作用的研究

【摘要】实验目的：随着计算机的普遍应用，使用者眼睛长期受电磁辐射和强光刺激，瞬目率减少，引起泪膜不稳定，造成眼表损害，引发眼睛干涩、发痒、红肿等干眼症状。目前干眼症最基本的治疗方法是使用人工泪液。近年来人工泪液从增加水分润湿眼表治疗轻度干眼症，逐渐向修复受损眼表细胞治疗中重度干眼症的方向发展。壳聚糖具有良好的生物相容性、可生物降解且降解产物无毒，是理想的生物医用材料。壳聚糖及其衍生物在眼科方面的研究表明，其可以促进受损角膜上皮的愈合，促进结膜上皮细胞生长，可作为角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的组织工程材料，在眼表疾病治疗方面具有广泛的应用前景。本实验主要以高分子量壳聚糖化学制备的羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖为材料，制作蒸发过强型大鼠干眼症模型，并评价这两种材料对缓解该类干眼症状的作用效果。实验方法：1.化学合成法制备出羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖，并对其进行基团取代位置、取代度、分子量等理化性质的表征。2.在室内温度为22oC、空气相对湿度为20%的环境中，通过缝合大鼠的上下眼睑暴露角结膜6天来制作动物干眼症模型，并通过SchirmerI试验、泪膜破裂时间检测、荧光素钠染色以及病理组织切片来评价该模型建立效果。3.评价羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖对造模成功的大鼠干眼症的缓解作用。以无菌泪液缓冲液为阴性对照、市售玻璃酸钠为阳性对照，将羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖配成具有一定pH值和渗透压的水溶液，对模型组大鼠每天滴眼3次，分别于滴眼后2天、4天、7天、14天对各组大鼠进行眼表检查，泪液分泌量检测、荧光素钠染色观察、泪膜破裂时间检测、组织病理学切片检查等。4.体外大鼠眼结膜杯状细胞的原代培养。无菌环境下完整取下大鼠眼球，剪取结膜组织部分，置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，以组织块培养法进行培养。显微镜下观察迁出细胞形态，并通过免疫荧光染色鉴定结膜杯状细胞的迁出生长情况。实验结果：1、对羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖的基本理化性质的测定结果显示羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖的取代位均主要在C6位的羟基上，羧基取代度为0.98，羟乙基取代度为3.11，分子量分别为196kD和124kD。2、通过缝合大鼠的上下眼睑暴露角结膜的干眼症模型组动物，其泪液分泌量相对于正常组动物明显下降，泪膜破裂时间缩短、角膜上皮细胞部分缺失。眼球组织切片可见模型组动物的眼球结膜、穹窿部结膜和睑结膜中杯状细胞数量急剧降低。上述结论说明大鼠干眼模型制作成功，并为后面研究壳聚糖衍生物对干眼症的缓解作用奠定了基础。3、本研究配制的羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖两种滴眼液的pH值分别为7.31和7.39，渗透压分别为319mOsm/kg和317mOsm/kg，均符合眼部用药的基本要求。随着滴眼液滴眼时间的增加，泪液缓冲液阴性组大鼠的各项眼表泪液指标均较模型组的变化不明显，角膜损伤至第14天仍为阳性，泪液分泌量虽有所增加但只恢复至正常组的约40%。玻璃酸钠组大鼠的角膜损伤至第14天已完全恢复，其泪液分泌量自第4天起明显增加，至第7天已恢复至正常大鼠的85%，其后变化不大；羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖改善大鼠干眼症状的效果与玻璃酸钠类似。眼表组织病理切片HE染色、AB-PAS、MUC5AC免疫荧光染色结果表明玻璃酸钠、羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖均可促进角膜细胞的修复，随着滴眼时间的延长，大鼠眼球结膜、穹窿部结膜和睑结膜的杯状细胞的含量也大幅增加。这些结果表明羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖均能缓解大鼠蒸发过强型干眼症的症状，同时暗示这些物质可以通过促进结膜杯状细胞修复来发挥作用的。4、大鼠结膜杯状细胞的原代培养，培养第2天贴壁组织块边缘会长出少量细胞，到第4天细胞逐渐增多，细胞呈现多角形或梭形，第5天往后变化不明显，有悬浮的死细胞出现。原代培养第2天到第7天对迁出细胞进行免疫荧光鉴定，结果表明该时间段内杯状细胞的生长呈现先上升然后下降的趋势。结论：羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖对大鼠蒸发过强型干眼症起到了缓解作用，为治疗VDT干眼症的医学材料研究提供了实验依据。
【作者】周瑞雪；
【导师】彭燕飞；
【作者基本信息】中国海洋大学，生物工程（专业学位），2014，硕士
【关键词】干眼；羧甲基壳聚糖；羟乙基壳聚糖；结膜杯状细胞；

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