枯草芽孢杆菌转化体系的建立及应用

【摘要】在植物和病原物互作的过程中,植物在响应病原物入侵时有两种先天免疫机制。第一层免疫机制可以识别和响应许多种病原菌,甚至是非病原菌,该过程中植物识别的是进化较缓慢的微生物相关因子,比如细菌鞭毛蛋白、延伸因子,真菌细胞壁的几丁质等PAMPs(pathogen-associatedmolecularpatterns),该类分子诱发的植物免疫反应称作PTI(PAMP-triggeredimmunity);第二层免疫机制可以直接或者间接识别和响应病原菌的毒性因子,该过程中植物细胞内的R蛋白识别病原菌产生的特异的因子,例如目前发现的大量的avr蛋白等,该类分子诱发的植物免疫反应称作ETI(effector-triggeredimmunity)。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为一种对环境无害的(GRAS,generallyrecognizedassafe)革兰氏阳性细菌,由于其在分泌表达外源蛋白方面具备巨大的优势,已经广泛的应用于医药、食品等行业。本研究欲将枯草芽孢杆菌改造成可以分泌表达植物源多肽和avr蛋白的工程菌。用到农业生产中以增强植物对病原物的抵抗能力。本研究主要完成了以下工作：1、以pMarA载体为基本骨架,利用P43启动子、nprB信号肽、大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2终止子、kan抗性表达框以及amyE基因的5’端和3’端,成功构建了枯草芽孢杆菌整合表达载体pHR,并获得转化子；2、克隆了玉米B73自交系的ZmPROPEP1基因,并将该基因整合到枯草芽孢杆菌整合表达载体pHR和植物表达载体pCAMBIA3301上；3、合成了番茄叶霉菌(Cladosporiumfulvum)的avr9基因,分析了农杆菌瞬时表达载体pAvr4载体上的avr4基因表达框结构,并将avr9基因和avr4基因以多种形式构建到枯草芽孢杆菌的表达载体上,并获得avr9基因和avr4基因的枯草芽孢杆菌转化子；4、构建了pBE2N-avr4、pHY300-avr4枯草芽孢杆菌表达载体,检测了pBE2N-EGFP表达载体在枯草芽孢杆菌中的表达效果,并分析了不同大小的载体转化枯草芽孢杆菌的效率,以及在枯草芽孢杆菌中的稳定性。
【作者】周伦；
【导师】董五辈；
【作者基本信息】华中农业大学，植物病理学，2014，硕士
【关键词】枯草芽孢杆菌；转化体系；植物免疫系统；信号肽；稳定性；番茄叶霉病；

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