柿原花色素前体跨膜基因MATE表达分析及功能验证

【摘要】柿果肉中存在特化的单宁细胞,其液胞中大量累积的原花青素(柿单宁)是导致其涩感的主要原因。已有研究表明,MATE为一类转运蛋白,在原花青素合成途径中其转运前体物质表儿茶素进入液泡并聚合成单宁,但其功能在柿中并未得到验证。本研究以中国甜柿‘鄂柿1号’(DiospyroskakiThunb.’Eshi1’,C-PCNA)为试材,以日本甜柿‘阳丰’(’Youhou’,J-PCNA)和非完全甜柿‘磨盘柿’(’Mopanshi’,non-PCNA)为对照,研究柿果实发育时期可溶性及不溶性原花色素含量的动态变化；分析DkMATE1基因在不同脱涩类型(C-PCNA、J-PCNA、non-PCNA)、不同发育时期(花后5、10、15、20、25周)、不同组织器官(花、茎、叶、萼片、果皮、果肉、果心)的表达模式；通过转化拟南芥和洋葱表皮亚细胞定位确定其功能,从而探讨跨膜转运基因MATE与中国甜柿自然脱涩的关系,以期为明确中国甜柿自然脱涩的分子机理提供科学依据。主要研究结果如下：1.不同脱涩类型果实原花色素含量的动态变化。不同脱涩类型(中国甜柿、日本甜柿和非完全甜柿)果实花后5周原花色素含量最高,并随着果实发育逐渐下降；‘阳丰’花后10周即可完成自然脱涩(可溶性单宁含量≤0.2%),但‘鄂柿1号’和‘磨盘柿’尚未脱涩；花后25周(果实成熟前一周左右)中国甜柿‘鄂柿1号’自然脱涩,但非完全甜柿‘磨盘柿’可溶性单宁含量仍然较高。与‘阳丰’完全不同的是在花后10周,‘鄂柿1号’不溶性单宁含量上升,至花后15周达到高峰,而‘阳丰’和‘磨盘柿’的不溶性单宁持续下降,推测中国甜柿自然脱涩过程中存在有可溶性原花色素向不溶性原花色素转化的现象。2.DkMATE1基因在不同时期、部位及脱涩类型中的表达模式。DκMATE1在三类脱涩类型柿品种的花、叶、茎、萼片、果皮、果肉、果心中均有表达,并均在叶中表达量最高,说明DκMATE1并非果实特异性表达基因。DκMATE1在‘鄂柿1号’花后10周至花后20周,其表达量有上升的趋势,而‘阳丰’和‘磨盘柿’中表达量持续下降,从中推测：DκMATE1编码的跨膜转运蛋白对原花色素前体的选择性运输,可能是中国甜柿与日本甜柿原花色素成分有别,从而导致两者自然脱涩机理明显有别的根本原因之基因的亚细胞定位与功能验证。通过农杆菌介导的拟南芥ttl2突变体3.DkMATE1种子因缺少TT12基因而导致单宁累积减少,使其种皮颜色呈现浅黄色,转基因T2代种子恢复野生型拟南芥种皮颜色,表现为黄褐色。表明,DκMATE1能够将tt12DκMATE1●突变体表型恢复至野生型表型,具有将原花青素前体物质转运至液泡的功能。通过基因枪介导的洋葱表皮亚细胞定位分析,DkMATE1转运蛋白定位在液泡膜上,这与其转运单宁前体物质的功能相符。4.DkMATEl启动子结构分析。通过染色体步移法扩增得到1000bpDkMATEl启动子序列,利用启动子软件分析得到该序列含有多个MYB类蛋白的顺式作用元件,如MYB1AT、MYBCORE、MYBPLANT、MYBST1,同时存在MYC转录因子和WRKY转录因子所特异识别的顺式作用元件。表明DkMATEl基因受MYB等转录因子的调控。综上所述,MATE作为一类定位在液泡膜上的转运蛋白,其编码基因DkMATEl上调表达与中国甜柿自然脱涩有一定联系,可能说明其与原花色素前体的选择性运转有关,值得进一步探讨。
【作者】蒋云；
【导师】罗正荣；
【作者基本信息】华中农业大学，果树学，2014，硕士
【关键词】中国甜柿；自然脱涩；MATE阿基因；原花色素；遗传转化；亚细胞定位；启动子；

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