猪IFITM3与口蹄疫病毒VP0蛋白相互作用的研究

【摘要】口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)是一种人畜共患的急性,热性,高度接触性的病毒性传染病(陈溥言等2009),主要引起偶蹄类动物发热,四肢、口、舌、鼻和乳房等部位形成水泡和溃烂。口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)基因组为单股正链RNA,可编码12个成熟的病毒蛋白,其中VPO蛋白是病毒的结构蛋白之一,与病毒入侵细胞密切相关。本实验室发现SIFITM3蛋白具有抗病毒效果,为了进一步探索SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖的机制,本研究利用酵母双杂交、细胞共定位和GST-PullDown技术验证口蹄疫病毒VPO蛋白与SIFITM3蛋白间的相互作用,并通过缺失突变验证SIFITM3蛋白与口蹄疫病毒VPO蛋白相互作用的关键位点及缺失后的SIFITM3蛋白抗口蹄疫病毒功能的变化,通过杆状病毒表达系统表达SIFITM3蛋白和VP2蛋白(VPO蛋白主要亚基),为研究蛋白间的直接相互作用奠定基础,主要研究内容如下：一、FMDVVPO蛋白与SIFITM3蛋白的相互作用通过PCR扩增FMDVVPO基因和猪源IFITM3基因氨基端胞外区1-165bp(nsIFITM3),EcoRI和SalI双酶切后连接入酵母表达载体pGBKT7;EcoRI和XhoI双酶切后将VPO基因和nsIFITM3基因连接入酵母表达载体pGADT7,获得重组质粒pGBKT7-VP0、pGBKT7-nsIFITM3和pGADT7-VP0、pGADT7-nsIFITM3.将pGBKT7-VP0和pGADT7-nsIFITM3、pGBKT7-nsIFITM3和pGADT7-VP0分别共转化酵母Y2HGold,进行酵母双杂交试验,结果表明VPO蛋白与IFITM3蛋白存在相互作用。为了进一步验证VPO蛋白与IFITM3蛋白之间的相互作用。采用荧光共定位技术进行研究,结果表明VPO蛋白广泛分布于细胞的胞浆和胞膜中,SIFITM3蛋白分布在细胞的胞膜上,VPO蛋白与SIFITM3蛋白在细胞中均定位在细胞的胞膜。利用原核表达技术,表达SIFITM3蛋白和VPO蛋白,通过包涵体提取和复性技术,获得目的蛋白,进行GST-PullDown试验,未检测到SIFITM3蛋白和VPO蛋白的相互作用。分析原因,可能因为复性的包涵体蛋白与天然结构存在差异。免疫共沉淀试验结果表明SIFITM3蛋白和VPO蛋白存在相互作用,为了深入研究SIFITM3蛋白与VPO蛋白相互作用的关键位点,构建了一系列部分缺失的SIFITM3真核表达质粒pLenti7.3-sIFITM3(31-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(61-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(91-432)-V5.pLenti7.3-IFITM3(121-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(151-432)-V5和pLenti7.3-IFITM3(1-165)-V5.将上述SIFITM3缺失的质粒分别与pFlag-VPO质粒共转染293T细胞后收集样品进行免疫共沉淀试验,结果表明截短的SIFITM3蛋白与FMDVVPO蛋白均无相互作用。二、SIFITM3蛋白不同部分缺失后对FMDV病毒增殖的影响由于不同部分的缺失,导致SIFITM3蛋白无法与FMDVVPO蛋白发生相互作用,为了研究SIFITM3缺失蛋白对抗病毒功能的影响,将重组质粒pLenti7.3-sIFITM3-V5,pLenti7.3-sIFITM3(31-432)-V5pLenti7.3-IFITM3(61-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(91-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(121-432)-V5、pLenti7.3-IFITM3(151-432)-V5、pLenti7.3-eGFP-V5转染BHK细胞后,接种FMDV,进行空斑减少试验,结果表明只有sIFITM3蛋白能够抑制病毒的增殖。三、构建分别表达SIFITM3和FMDVVP2蛋白的重组杆状病毒通过在线软件TMHMMServer,v.2.0分析SIFITM3蛋白的结构,找出跨膜区。将SIFITM3基因跨膜区去除,拼接剩余片段,通过基因合成技术获得拼接基因PsIFITM3=扩增PsIFITM3.SIFITM3氨基端1-165bp片段(sIFITM3(1-165)).蜂素信号肽连接氨基端1-165bp片段(FsIFITM3(1-165))、FMDVVP2基因、蜂素信号肽连接VP2基因(FVP2),HindⅢ和XhoI双酶切后插入到pFBDpH-HA-NA-M1载体中,获得重组质粒pFBD-VP2.pFBD-FVP2.pFBD-PsIFITM3、pFBD-sIFITM3(1-165)和pFBD-FsIFITM3(1-165).将上述重组质粒转化DH1OBac感受态细胞,通过蓝白斑技术筛选,提取阳性重组杆粒,转染Sf9细胞,从而获得重组杆状病毒rBacmid-VP2、rBacmid-FVP2、rBacmid-PsIFITM3、rBacmid-sIFITM3(1-165)和rBacmid-FsIFITM3(1-165)。将上述重组杆状病毒感染Sf9细胞,WesternBlot检测蛋白表达情况,结果表明相应目的蛋白均能够表达。本研究为后续纯化蛋白,进行SPR试验和蛋白结晶试验奠定基础。
【作者】米鹏；
【导师】钱平；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】口蹄疫；结构蛋白VP0；猪源干扰素诱导蛋白sIFITM3；酵母双杂交；杆状病毒；蛋白相互作用；

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