鸭疫里氏杆菌ECFs sigma基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

【摘要】鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（.Riemerellaanatipestifer,RA）引起的家鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种细菌性传染病,由于该病分布范围广、发病率和死亡率高,现已成为危害世界养鸭业的重要的传染病之一。由于RA血清型较多,血清型之间交叉保护作用低,目前在生产中对该病的防控主要使用抗生素,但RA对抗生素易产生耐药性,并且容易造成食品中的药物残留。因此,加强RA分子生物学、致病和免疫机制的研究,对从根本上防制该病的发生具有重要的意义。6因子是细菌DNA依赖的RNA聚合酶的一个亚基,它识别启动子共有序列且与核心酶结合起始基因转录。胞质外功能性σ因子（Extracytoplasmicfuctionalsigmafactors,ECFs）属于σ70蛋白家族,它介导细菌在面对环境变化时做出适应性反应。ECF因子在病原菌适应外界环境胁迫、侵袭和感染宿主的过程中发挥着重要的作用。鸭疫里氏杆菌RA-YM株基因组中含有5个编码ECF因子的基因,为了研究ECF因子在鸭疫里氏杆菌致病中的作用,本研究利用同源重组技术构建了RA-YM株ECFs（RAYM03547,RAYM00365、RAYM08835）基因缺失突变株,对基因缺失突变株的生长特性、生化特性、对雏鸭致病性以及在环境胁迫情况下的生长特性进行了研究。具体研究内容如下：1、鸭疫里氏杆菌RA-YM株ECFs基因缺失突变株的构建与鉴定以RA-YM株基因组为模板,分别扩增ECFs（RAYM00365,RAYM08835、RAYM03547）基因上、下游同源臂,采用重叠PCR方法将上、下游同源臂与壮观霉素基因连接在一起,构建壮观霉素抗性基因表达盒并连接到自杀性质粒pRE-112。将构建成功的自杀性质粒pRE-ECF转化E.coliX7213,以含有pRE-ECF的E.coliX7213作为供体菌,以RA-YM株为受体菌,采用双亲本接合转移的方法筛选RA-YM株ECF突变株。挑取壮观抗性TSA平板上的菌落,连续传5代,利用PCR鉴定ECF缺失突变株,成功构建了鸭疫里氏杆菌3个ECF基因（RAYM03547,RAYM00365、RAYM08835）缺失突变株。2、鸭疫里氏杆菌RA-YM株ECFs基因缺失突变株生物学特性研究比较了RA-YM株ECFs基因缺失突变株RA-YMARAYM00365、RA-YMARAYM08835、RA-YMARAYM03574与亲本株的生长特性和生化特性,结果发现3个ECF基因缺失突变株与亲本株在对数生长期的生长速度差异不明显,ECF基因基因缺失突变株的生化特性没有发生改变。比较ECFs基因基因缺失突变株与RA-YM在环境胁迫下的生长发现：3个ECFs基因缺失突变株在含H2O2、胆盐和酸性环境下生长变慢,表明ECFs基因缺失突变株对环境胁迫（H2O2、胆盐、酸性）的耐受能力降低。3、鸭疫里氏杆菌RA-YM株ECFs基因缺失突变株对雏鸭毒力研究比较了3个ECF基因缺失突变株与亲本株对10日龄雏鸭的毒力,结果显示RA-YMARAYM00365、RA-YMARAYM08835、RA-YMARAM03574的LD50分别为3.16×106、3.98×106、5.01×106,与亲本株（LD50为5.01×106）差异不大,ECFs基因缺失突变株与亲本株在血液和肝脏组织的载菌量没有显著性差异（P>0.05）。鉴于本研究中对3个ECFs基因缺失突变后,其致病性并没有发生显著性变化,推测原因可能是与毒力相关的ECF主效基因尚存在于基因组中有关,或可能在鸭疫里氏杆菌中需要多个ECF参与协同致病,下一步研究将开展RAYM04606、RAYM06105单基因和多基因缺失突变株的研究。
【作者】谢妙妙；
【导师】毕丁仁；周祖涛；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】鸭疫里氏杆菌；胞质外功能性σ因子；基因缺失突变；生物学特性；环境胁迫；

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