猪肝羧酸酯酶1水解磺胺类药物的特性研究

【摘要】猪肝羧酸酯酶(Pigliveresterase,PLE),属于丝氨酸蛋白酶,是由多种同工酶组成的酶家族,其中猪肝羧酸酯酶1(PLE1)含量较高,是该家族的重要成员。PLE具有高度的水解活性和立体选择性,成为有机合成中主要的水解酶之一。但PLE作为药物代谢酶的角色,在猪的药物代谢和解毒中是否发挥作用尚未见报道。据其在有机化学合成中显示出的强大水解活性,以及人类CES显示出的重要药物代谢和解毒作用,推测PLE可能在猪用药物代谢中发挥不可忽视的作用,并由此影响药物的疗效和毒副作用,因此,本课题拟研究PLE1是否水解临床兽药、水解特点及机制,为猪临床合理用药提供必要的理论依据,具有重要的理论和实践意义。本课题在功能性表达PLE1的基础上,首先通过PLE1的体外水解抑制试验,快速检测了83种临床上常用的各种类型兽药对PLE1水解p-NPA的抑制作用,以筛选获得可能被PLE1水解的兽药种类；测定了兽药对PLE1的抑制常数,以确定抑制类型,进一步预测药物被PLE1水解的可能性；建立高效液相色谱(HPLC)及液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等仪器分析方法,定量检测PLE1对兽药的水解,确定兽药是否被PLE1水解,分析PLE1对兽药的米氏常数与药物对PLE1的抑制常数的相关性,以佐证结果的可信度；最后,跟据人的CES晶体结构,建立PLE1同源模型,将兽药分子与之对接,阐明PLE1催化水解兽药的机理。具体研究内容和结果如下：1.药物抑制PLE1水解p-NPA的情况测定了83种兽医临床常用药物(化学合成抗菌药、抗生素、抗真菌药物、抗寄生虫药物、解热镇痛抗炎药、局麻药物)对PLE1水解p-NPA的抑制作用,结果只发现抗生素和化学合成抗菌药中的某些药物具有不同程度的抑制作用,如属于抗生素的泰乐菌素显著抑制PLE1的水解活性(0.01<P<0.05)；化学合成抗菌药中的磺胺类药物酞磺噻唑(PST)与磺胺异恶唑(SIZ)极显著抑制PLE1的水解活性(P<0.01),磺胺氯哒嗪(SCP)显著抑制PLE1的水解活性(0.01<P<0.05)。2.HPLC测定PLE1对泰乐菌素的水解建立泰乐菌素的HPLC定量方法,测定经PLE1水解前后泰乐菌素浓度的变化。结果显示泰乐菌素并未被PLE1所水解,说明仅凭对PLE1的水解产生抑制作用的结果不能预测兽药是否是PLE1的适宜底物,结合抑制作用类型的确定可望提供进一步的参考。3.磺胺类药物对PLE1抑制类型的确定以p-NPA为底物,测定并计算了24种磺胺类药物对PLE1水解的抑制常数,发现不同的磺胺类药物对PLE1的抑制常数不同,但各磺胺类药物的Alpha值均大于1,显示磺胺类药物抑制PLE1水解的类型均为竞争性抑制,即这24种磺胺类药物和通用底物p-NPA与PLE1结合的位点相同,提示磺胺类药物很有可能被PLE1催化水解。查询PubChemCompound网站获取24种磺胺类药物的分配系数XlogP值,将XlogP值与logKi值进行相关性分析,发现两者呈现出一定的相关性,即在一定范围内(XlogP值为0.1-1.5),随着XlogP值的不断增大,logKi值出现先降后升的趋势,并在XlogP=1.0时,达到最低值,即抑制程度最大。说明磺胺类药物对PLE1的抑制与其结构(分配系数)有关。4.LC-MS/MS测定PLE1对磺胺类的降解作用建立了检测磺胺类药物的LC-MS/MS方法,采用乙腈与0.1%的甲酸水作为流动相,通过梯度洗脱使药物得到良好的分离,使用全扫描方式对药物进行定量定性分析。大部分磺胺类药物在1-32ppb范围内线性关系良好(r_>0.999)。测定了PLE1对不同浓度下的24种磺胺类药物的降解速度,计算了PLE1对24种磺胺类药物的米氏常数Km与催化降解的最大反应速率Vmax。结果表明,绝大多数磺胺类药物浓度在PLE1作用下有明显降低,说明PLE1对绝大多数磺胺类药物有明显的催化降解作用。对磺胺类药物的logKm值与logKi值进行相关性分析,发现logKm值与logKi值显著正相关(0.01<P<0.05),说明不同磺胺类药物与PLE1的亲和性越大,其对PLE1催化水解通用底物的抑制越明显,反之亦然。5.同源模建及分子对接构建了PLE1三聚体及单体的3D结构模型,并与不同的磺胺类药物进行分子对接。结果显示,磺胺类药物与PLE1活性中心的结合方式与其通用底物p-NPA类似,磺胺类药物分子中的硫原子可能扮演了p-NPA中的羰基碳原子的角色。对PLE1有抑制作用的磺胺类药物与酶的结合能量普遍低于酶与通用底物(p-NPA)的结合能量,说明磺胺类药物与酶的亲和性普遍高于通用底物p-NPA与酶的亲和性,提示磺胺类药物是PLE1的合适底物,可被PLE1水解。
【作者】闫慧平；
【导师】石德时；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】猪肝羧酸酯酶1；磺胺类；液相色谱-串联质谱；同源模建；分子对接；

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