禽致病性大肠杆菌全基因组测序与比较基因组学分析

【摘要】禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichia.coli,APEC)为禽大肠杆菌病病原,可引起家禽局部或全身性感染,主要造成家禽败血症(sepsis)、心包炎(pericarditis)和气囊炎(airsacculitis)等,该病原菌在世界范围内的流行对家禽业造成巨大的经济损失。目前,虽然很多与APEC菌株致病力相关的毒力因子已经被报道,但是,不同来源和不同致病型菌株之间基因组的多样性和频繁的转座事件及基因的水平转移,为APEC的致病机制研究带来很多困难。当前,关于APEC的致病机制仍不甚清楚。随着第二代高通量测序技术的普及和第三代测序技术的开发,测序成本越来越低,获得序列信息的病原微生物越来越多,为揭示病原微生物的致病机制及其规律提供了新的行之有效的方法。目前,NCBI基因组数据库中只有2株APEC的全基因组序列信息,对APEC菌株的全基因组信息了解还比较少,为了更好地研究禽致病性大肠杆菌的遗传规律和致病机制,我们选取了2株APEC优势血清型078血清型菌株,进行了全基因组的测序和比较基因组分析的研究,主要研究内容包括：1.禽致病性大肠杆菌全基因组测序本研究中利用Roche公司454GS-FLX测序平台对2株APEC菌株ACN001和ACN002进行全基因组序列的测定,并对其基因组缺口进行了人工修补和序列拼装注释,获得两个环状基因组序列。其中,ACN001的基因组大小为4,936,576bp,测序覆盖度为23.6,预测编码基因有4794个,基因组平均GC含量为50.67%,7套16s-23s-5s核糖体rRNA操纵子,86个tRNA;ACN002的基因组大小为4,879,931bp,测序覆盖度为35.8,预测编码基因有4677个,基因组平均GC含量为50.69%,7套16s-23s-5s核糖体rRNA操纵子,85个tRNA。除此以外,ACN001和ACN002菌株中分别含有6和7个质粒,其中包括毒力质粒和多重耐药质粒。同时,我们还对两菌株的插入序列、噬菌体相关编码基因等基本特征进行了预测分析,在ACN001和ACN002的染色体基因组中,分别预测到了39和37个可信的IS元件,同时分别预测到8和6个簇状排列的原噬菌体区域,这些原噬菌体区域中都包括了结合位点、整合酶、转座酶、tRNA以及噬菌体组装相关等基因。2.禽致病性大肠杆菌比较基因组学分析将本研究中2株完整测序的菌株ACN001和ACN002进行全基因组共线性比较分析,结果表明ACN001与ACN002的基因组共线性较好,我们共发现并定位了7处存在于ACN001与ACN002之间的插入或缺失序列,以及2处发生移位的片段。根据功能注释结果推测,这些插入缺失区域都是噬菌体水平转移而来。同时我们发现,ACN002基因组相较于ACN001基因组,存在一段长约685kb的大片段倒位区,我们对倒位以及插入缺失的差异区域进行生物学功能分析,发现黏附素编码基因aidA和铁转运系统跨膜蛋白编码基因tonB在ACN001基因组中是完整的,而在ACN002基因组中却是不完整的。同时,我们比较和分析了ACN001和ACN002菌株在毒力质粒、耐药质粒、铁摄取系统、鞭毛基因簇和Ⅰ型菌毛基因簇上的异同,发现ACN001和ACN002的基因组在Ⅰ型菌毛fim基因簇、铁摄取相关的耶尔森菌素Ybt系统、鞭毛flg基因簇、毒力质粒和耐药质粒上都存在着一定的差异。通过以上分析,从基因水平上阐释了两者致病性差异的分子基础,为进一步探究APEC的遗传规律和致病机制提供依据。我们将ACN001和ACN002与NCBI基因组数据库中己公布的APECO1(GenBank登录号：NC008563)和APECO78(GenBank登录号：CP004009)进行同源基因聚类(orthologous)分析,获得了5739个基因簇,其中,4株菌株共有的基因簇即核心基因簇(core-genome)有3246个,占总基因簇的56.56%。发现同为078血清型B1群系的ACN001、ACN002和APECO78所共有的基因簇(689个)明显多于其他组合,APECO1与另外3株菌株中任意一株所共有的基因簇总是少于其他组合。在分析各个菌株所特有的基因簇时,发现APECO1所特有的基因簇是最多的(723个),明显多于其他菌株。结果表明ACN001、ACN002与APECO78进化关系较近,而与APECO1菌株的进化关系则较远。3.禽致病性大肠杆菌基因组进化分析本研究中,我们共选取了包括ACN001和ACN002在内的48株大肠杆菌基因组序列、5株志贺氏菌和1株费格森埃希菌序列,再将这54株菌株基因组中的7个看家基因(adk,fumC,gyrB,icd,mdh,purA,andrecA)的序列串联,最终绘制了系统发育进化树。进化分析结果表明ACN001与ACN002的亲缘关系较近,同时,两者与同血清型同群系的APECO78有较近的亲缘关系,而与APECO1有较远的亲缘关系。这一结果也与基因组学中的COG分析和比较基因组学中orthologous分析结果相一致。
【作者】魏留亚；
【导师】陈焕春；谭臣；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】禽致病性大肠杆菌；全基因组测序；比较基因组学分析；毒力因子；

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