StPP2C和StABF对马铃薯块茎形成的影响

【摘要】块茎是马铃薯的繁殖器官,也是重要的产品器官。马铃薯块茎形成受到光周期、蔗糖、温度、激素等因素影响,并且与马铃薯块茎形成相关的基因众多。本实验室通过RNA测序(RNA-seq)技术筛选到在蔗糖及光周期处理下差异表达的基因,但是这些基因在马铃薯块茎形成过程中所发挥的作用还尚未明确。本研究从马铃薯品系E26中克隆了4个对光周期或蔗糖响应的StPP2C以及对光周期响应的StABF,并利用基因表达谱和转基因等技术初步分析了StPP2C及StABF与马铃薯试管薯形成的关系,从而探究其在块茎形成中的作用。主要结果如下：1.通过RT-qPCR方法从8个差异表达的StPP2C基因中筛选到了4个StPP2c基因,另外还筛选到1个StABF基因,其中StPP2Cl.StPP2C4响应蔗糖,StPP2C6.StPP2C7、StABF响应光周期。扩增获得了5个基因的全长开放阅读框(ORF),片段大小均为1200bp左右。聚类分析结果显示,受蔗糖和光周期诱导的StPP2C基因分别具有较近的亲缘关系。2.为了分析StPP2Cl、StPPC4及StABF对蔗糖的具体响应情况,将E26试管苗在2%蔗糖下培养3周后分别加入2%与10%蔗糖的液体MS培养基培养5天,第一天每4小时取样,其后每1天取样以测定三者的表达水平。结果显示,StPP2Cl和StPP2C4在蔗糖处理4小时高浓度蔗糖(8%蔗糖)中基因的表达量明显高于低蔗糖浓度(2%蔗糖),达到4倍以上,并且其表达差异最大都达到了25倍,StPP2Cl的差异峰值出现在处理1天,而StPP2C4出现在处理20小时。处理1天之后,8%蔗糖和2%蔗糖处理下的基因表达量仍表现出明显的差异,但两者的表达量均有一定的降低,说明这两个基因对蔗糖浓度响应并且早期更加明显。StABF基因在处理1天内8%蔗糖下的表达量明显高于2%蔗糖下的表达量,最高达到了15倍,但是1天后,两者浓度处理下StABF基因的表达量差异没有达到两倍以上,因此,我们认为StABF基因在早期时对蔗糖响应。3.为了分析StPP2C6、StPP2C7和StABF对光周期的具体响应情况,将E26试管苗在长日照条件下(16h光照/d)培养3周后分别转入到长日照和短日照(8h光照/d)培养2天,期间每4小时取样测定各基因表达水平。StPP2C6和StPP2C7均表现出了一定的节律性,StPP2C6在短日照(SD)处理8小时,此时刚好进入黑暗其表达量开始上升,在SD处理16小时达到了最高值,而后表达量逐渐降低但是波动不是很明显；StPP2C7在长日照(LD)下进入黑暗时表达量都是升高的,而在短日照下,在进入黑暗后前8个小时表达量逐渐升高而在后8个小时表达量又回落。StABF表现出较明显的光周期节律性,LD条件下,光照时StABF的表达量升高,进入黑暗后表达量逐渐降低；SD条件下,光照时StABF的表达量逐渐升高,到进入黑暗12小时后开始下降,并且两天的表达趋势是一致的。4.为了研究StPP2C是否存在体外活性,本研究构建了StPP2C基因体外表达载体PP2C_GEX,进行体外表达和纯化,并且测定了蛋白磷酸酶2C的体外活性。结果显示,StPP2C1.StPP2C4.StPP2C6.StPP2C7分别使底物析出游离磷为2.21nmOl、1.05nmol、1.22nmol、2.62nmol,证明了StPP2C基因具有蛋白磷酸酶2C活性。5.为了研究StPP2C基因的亚细胞定位,构建了StPP2C基因的绿色荧光蛋白(GFP)融合载体。结果显示,StPP2C1基因主要定位在细胞膜,StPP2C4基因主要定位在细胞核,StPP2C6与StPP2C7基因的定位尚未完成。6.为了分析StPP2C.StABF与位于同一ABA信号途径上的蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶(SnRK1)是否存在互作,构建了PP2C-GBK与ABF-GBK载体,采用酵母双杂交的方法证明了StPP2C6.StABF与SnRK1存在互作。7.为了研究4个StPP2C基因和1个StABF基因对马铃薯试管薯形成的影响,构建了组成型启动子CaMV35S驱动的StPP2C和StABFRNAi干涉载体,以鄂马铃薯3号(E3)为受体进行马铃薯遗传转化,获得了68个转基因阳性株系。经RT-qPCR分析,所干涉基因在各转基因株系中都呈现出不同程度的下调表达,干涉效率最高达到了99%。对每个干涉载体选取的6株转基因株系和E3分别进行光周期处理和蔗糖处理,之后进行结薯统计。结果显示,StPP2C1.StPP2C4干涉株系与E3相比,其单株结薯数和单薯重都有所降低,两者在2%、4%和8%蔗糖浓度下,单株结薯数和单薯重也依次提高。说明这两个基因是受蔗糖诱导的基因,并且对马铃薯试管块茎形成有一定的作用。StPP2C6、StPP2C7、StABF干涉株系与E3相比较,在SD下其单株结薯数同样呈下降的趋势,但在LD下则没有差异,说明这些基因在SD条件下影响马铃薯试管薯的形成,而在LD条件下对试管薯形成没有作用。
【作者】叶晖；
【导师】谢从华；
【作者基本信息】华中农业大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】马铃薯；块茎形成；StPP2C；StABF；SnRK1；

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