龙井43号多酚氧化酶同工酶质谱鉴定与酶性质研究

【摘要】多酚氧化酶(PPO)多年来一直是国内外研究的热点,对茶叶品质的形成起关键作用,然而目前缺乏深入开展PPO单一同工酶的研究。本课题以龙井43号为材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等获得3个PPO单一同工酶PPOⅠPPOⅡ、PPOⅢ,通过MALDI串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-TOF质谱仪)对3个同工酶进行了初步鉴定。并对PPOⅡ酶性质进行了分析。主要研究结果如下：1PPO同工酶的获取以缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析、SephadexG-150凝胶过滤层析等步骤可以有效地分离纯化茶树PPO同工酶。经以上各步分离纯化,共获得3个茶树PPO同工酶,分别为PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,比活力分别为964.63、2325.39、2406.78U/mmg,分子量分别约为34kDa、53kDa、85kDa。2茶树PPO同工酶质谱鉴定通过质谱鉴定PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,经检索得到四种类似的物质：胞质核糖体蛋白、乳酰谷胱甘肽裂解酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白和蛋氨酸合成酶,前两个为PPOⅠ检测结果,后两个分别为PP0Ⅱ和PPOⅢ检测结果。PPOⅠ检测得到两种类似物质：一种类似于茶树(Camelliasinensis)的胞质核糖体蛋白(cytoplasmicribosomalprotein),分子量为17267Da,pI10.26；另一种类似片段来源于水稻中的乳酰谷胱甘肽裂解酶(Lactoylglutathionelyase),分子量为32875Da,pI5.51.PPOⅡ类似于存在于茶科植物Frankliniaalatamaha中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白(ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunitprotein),该物质分子量为53050Da,pI6.13。PPOⅡ可能与光合作用有关。PPOIII类似于存在于茶树(Camelliasinensis)中分子量为85180Da,pI6.14的蛋氨酸合成酶(methioninesynthase)。该物质可能与蛋氨酸和叶酸循环有关,调节生物体的生理过程。3PPO同工酶酶学性质研究以邻苯二酚为底物,采用分光光度法对茶叶多酚氧化酶同工酶进行抑制剂、温度、pH、Cu2+浓度等酶学性质的研究。结果表明：同工酶PPOⅡ最适pH为6.0；PPOⅡ催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km=13.05mmol/L,Vmax=0.019OD460/min;抑制剂抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸对PPOⅡ同工酶都有抑制作用,并且随着抑制剂浓度的增加残留酶活性降低；PPOⅡ的活性随着Cu2+浓度的增加先上升后下降,在Cu2+浓度为0.25х10-7mol/L时酶活性最高,当金属离子Cu2+浓度达到2х10-7mol/L时,PPOⅡ活性消失。
【作者】张书芹；
【导师】黄友谊；
【作者基本信息】华中农业大学，茶学，2014，硕士
【关键词】茶树多酚氧化酶；同工酶；纯化；质谱鉴定；酶学性质；

【参考文献】
[1]储海虹.基于鲁米诺电化学发光的生物传感技术研究[D].苏州大学,2011.
[2]赵曼曼.当代大学生服饰色彩研究[D].内蒙古师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[3]刘臻.促进湖南新型粮农规模经营的对策研究[D].湖南农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[4]孟凡丽,郑棋,李燕,卢成原.基于BP神经网络的深基坑围护变形预测[J].浙江工业大学学报,2014,04:367-372.
[5]李哲.浅析有限责任公司隐名出资人的法律地位[J].法制与社会,2014,23:96-97.
[6]宋诗高.新型乳化剂及引发剂在“零VOC”水性木器涂料中的应用[D].上海工程技术大学,材料加工工程,2013,硕士.
[7]杨新芳.辛开苦降法对NASH大鼠肝组织PPARα及L-FABPmRNA表达影响的实验研究[D].湖北中医药大学,中医临床基础,2013,硕士.
[8]王红军,陈庆新,陈新,郑德涛.基于效用分析的客户聚类方法研究[J].计算机集成制造系统-CIMS,2003,03:237-241.
[9]余昆,曹一家,陈星莺,郭创新,董成明.含分布式电源的地区电网无功电压优化[J].电力系统自动化,2011,08:28-32.
[10]陈佳丽.基于场景的面向方面软件体系结构评估方法[D].新疆大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[11]LiuLei.从顺应论视角研究电影《成为简·奥斯汀》的字幕翻译[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[12]李彬彬.循环miR-185对临床肝纤维化诊断价值的研究[D].第二军医大学,病理学与病理生理学,2013,硕士.
[13]唐鑫.布袋注浆桩处理铁路路基软弱地基的应用研究[D].西南交通大学,地质工程,2013,硕士.
[14]王娜.英语专业学生文化定势的研究[D].山东师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[15]代双和,王玮,陈志刚,罗谋兵,杨松岭,刘春芳,张欲晓.坡折带控沉积理论在乍得Bongor盆地油气勘探中的应用[J].石油地球物理勘探,2010,03:448-453+472+319.
[16]梁青,王传榜,潘金文,卫一恒,王永.线性自抗扰控制参数b0辨识及参数整定规律[J].控制与决策.
[17]陈敏.民事诉讼立案调解制度研究[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[18]程潇钰.食管癌组织中基因断裂及基因重排的鉴定[D].北京协和医学院,细胞生物学,2014,博士.
[19]姜小飞.SZ公司LED车灯项目融资方案设计[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[20]王菲.增塑PVC材料的搪塑成型—结构—性能相关性的分析[D].山东大学,材料学,2013,硕士.
[21]单莹莹.城市主支路交叉口右转交通组织优化研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[22]赵清.碳量子点荧光探针的制备及其在重金属离子分析中的应用[D].中北大学,材料学,2014,硕士.
[23]李志江.逆变电源控制方案的研究与实现[D].浙江大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[24]戴红.斑点追踪技术评价血压昼夜节律变化对原发性高血压患者左室收缩同步性运动的影响[D].广西医科大学,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[25]施琦锋.带有时域误差校正系统的高速高精度电流舵数模转换器设计[D].浙江大学,电路与系统,2013,硕士.
[26]徐帆.金属磁记忆检测技术的研究与应用[D].浙江大学,结构工程,2013,硕士.
[27]刘秀晨.那年,我在饮虎池抓螃蟹[J].北京政协.1996(12)
[28]张乐骏.安徽庐枞盆地成岩成矿作用研究[D].合肥工业大学,2011.
[29]尹中伟.蓝宝石单晶体裂纹振动扩展机理研究[D].哈尔滨工业大学,材料学,2014,硕士.
[30]王明月.高边坡的安全控制与优化设计[D].北方工业大学,岩土工程,2014,硕士.
[31]罗亿柳.绿色建筑成本效益评价研究[D].大连理工大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[32]刘一凡.我国环保企业发展现状与对策研究[D].北京交通大学,2013.
[33]赵贤慧.厌氧水解—生物接触氧化工艺处理低浓度城市污水试验研究[D].武汉科技大学,环境工程,2003,硕士.
[34]娄媛媛.基于独立学院学生和教师需求分析的《应用型大学英语》教材评估[D].浙江大学,外国语言学与应用语言学,2012,硕士.
[35]张盼.基于平衡计分卡的企业培训体系构建及应用研究[D].合肥工业大学,企业管理,2013,硕士.
[36]李凡.高速公路工程施工风险管理研究[D].北京交通大学,2013.
[37]肇小茗.薯蓣皂苷对扑热息痛诱导肝损伤的保护作用研究[D].大连医科大学,微生物与生化药学,2012,硕士.
[38]李志博.兰州拉面专用粉品质指标的研究[D].甘肃农业大学,作物遗传育种,2003,硕士.
[39]薛烨.当代中国婚姻责任研究[D].河北经贸大学,伦理学,2014,硕士.
[40]张东晓,鲁林,李翠华,金泰松.基于亚像素位移的超分辨率图像重建算法[J].自动化学报,2014,12:2851-2861.
[41]胡婷婷.多晶硅生产企业重大危险源辨识与风险分析[D].郑州大学,化学工程,2013,硕士.
[42]李亚楠.水溶性共轭聚合物荧光传感器的制备与应用[D].吉林大学,分析化学,2014,硕士.
[43]范成礼,邢清华,李响,王振江.带反向预测及斥力因子的改进粒子群优化算法[J].控制与决策,2015,02:311-315.
[44]周顺晔.激酶双靶点抑制剂的设计及Ⅱ型抑制剂解离通路的研究[D].苏州大学,无机化学,2014,硕士.
[45]冯磊.GPS周跳探测与修复方法研究[D].辽宁工程技术大学,大地测量学与测量工程,2012,硕士.
[46]宋琳琳.近红外光响应的柔性纤维状光伏电池：设计、组装以及光电性能测试[D].东华大学,材料工程（专业学位）,2014,硕士.
[47]郝晓玲.吗啡对大鼠海马神经元肌动蛋白重构的影响及机制研究[D].河北医科大学,药理学,2013,硕士.
[48]李芹.生态脆弱区耕地集约利用评价及农户集约行为模拟研究[D].西北大学,自然地理学,2013,硕士.
[49]郭冰.智能变电站综合状态监测系统的研究[D].南京理工大学,电气工程,2012,硕士.
[50]张金国,焦东升,王小君,朱洁,和敬涵,巩超.基于梯级利用电池的储能系统经济运行分析[J].电网技术,2014,09:2551-2555.