孕酮、雌二醇与IFN-τ调控奶牛子宫内膜上皮细胞表达GM-CSF的研究

【摘要】繁殖是奶牛业发展过程中最重要的环节之一,各种原因引起的早期胚胎流失、胎儿胎盘发育异常及新生幼畜发育迟缓等都会直接影响奶牛的数量和生产性能。奶牛妊娠的建立是一个很复杂的生理过程,主要包括妊娠识别和胚胎植入两部分。为适应妊娠,母体的生殖器官和组织结构以及免疫适应性均需发生适当的变化,细胞因子在该变化中起到至关重要的作用。GM-CSF在胚胎移植和胚胎发育过程中发挥着重要作用。GM-CSF、IFN-τ等因子可减弱局部妊娠免疫反应,从而保证妊娠的正常进行。妊娠期间,GM-CSF的不足可对胎儿及胎盘的发育造成不利的影响,并且可影响新生幼畜的生长发育。雌激素和孕酮一样,都是影响雌性动物生殖系统生长发育、维持胚胎成功植入和正常妊娠的重要激素。IFN-τ由反刍动物在胚胎附植前经滋养层细胞分泌,在妊娠早期,它可阻断黄体溶解途径、维持孕酮浓度,为胚胎附植、胎盘形成以及胎儿的正常发育和生长营造良好的子宫内环境。因此,研究雌激素、孕酮和IFN-τ调控子宫内膜上皮细胞表达GM-CSF的生物作用具有重要意义。本试验采用RT-qPCR和ELISA检测雌激素、孕酮和IFN-τ对体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞(5×105个/mL)GM-CSF表达的时空调节作用,结果如下。(1)以不同浓度梯度的外源性雌二醇(12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/rnL)作用不同时间(6h、12h、24h),RT-qPCR检测干预后细胞表达GM-CSFmRNA的丰度,ELISA检测GM-CSF蛋白表达量,分析各组间的表达差异性。RT-qPCR检测结果显示,在雌二醇单一因素的干预下,其对GM-CSF表达的上调作用表现为明显的时效关系和剂效关系。6h、12h、24h时,三个浓度组的(GM-CSF表达量与空白组相比均表现显著(P<0.05)/极显著的促进作用(P<0.01)。ELISA检测结果与RT-qPCR检测结果的趋势基本一致,均表现为随着时间的推移,由上调不明显逐渐表现为上调极显著(P<0.01)。(2)不同浓度的孕酮(2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)以不同时间(6h、12h、24h)干预奶牛子宫内膜上皮细胞。RT-qPCR检测结果显示,当孕酮作用6h,各组间均未见显著变化(P>0.05)；随着时间的延长,各浓度组的表达量均有所下降；当作用时间为24h时,各组均表现为显著的抑制作用(P<0.05)。从GM-CSF蛋白层面分析,各浓度组在6h、12h表现不同程度的抑制作用,在24h抑制现象更加显著(P<0.05)。GM-CSF从基因水平和蛋白水平均表现为平行下调趋势,且有随时间推移下调程度更加明显的现象。(3)IFN-τ(100ng/mL)单独干预奶牛子宫内膜上皮细胞,作用于不同时间(6h、12h、24h),通过RT-qPCR和ELISA检测GM-CSF表达的时空变化。RT-qPCR检测结果显示,与对照组相比,IFN-τ在各时间点对GM-CSF的表达均有促进作用。从GM-CSF蛋白水平分析,IFN-τ干预6h、12h未见促进作用,24h表现促进作用。在基因水平IFN-τ上调奶牛子宫内膜上皮细胞GM-CSF的表达；在蛋白水平,随时间的延长也表现为上调作用。(4)雌二醇(12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/ML)和孕激素(2.5ng/mL、5ng/mL10ng/mL)联合作用对子宫内膜上皮细胞GM-CSF表达的调控。结果显示,奶牛子宫内膜上皮细胞表达GM-CSF受雌二醇和孕激素的组成比例及作用时间调控。大致趋势为,当雌二醇的浓度一定时,随着孕酮浓度的递增,在基因和蛋白层面上,GM-CSF的表达会不同程度的降低,且随着时间的推延这种抑制现象更显著。(5)雌二醇(1/2E组：12.5pg/mL、E组：25pg/mL)和/或孕激素(1/2P组：2.5ng/mL、P组：5ng/mL)联合IFN-τ(100ng/mL)作用对子宫内膜上皮细胞GM-CSF表达的调控。RT-qPCR检测结果显示,作用6h后,IFN-τ对1/2E+P和E浓度组的作用不显著,但IFN-τ对1/2E、P、1/2P和E+1/2P浓度组均上调GM-CSF表达。其中,IFN-τ对1/2E和1/2P浓度组上调GM-CSF表达表现为极显著的协同作用(P<0.01)。作用12h后,除1/2P、E+1/2P浓度组外,1/2E、P、1/2和1/2E+P浓度组添加IFN-τ后均协同上调GM-CSF表达。作用24h后,添加IFN-τ后均促进GM-CSF表达。随着作用时间的延长,IFN-τ对各组GM-CSF表达表现不同程度的促进作用,但对GM-CSF蛋白的表达作用不显著。结论：雌激素上调子宫内膜上皮细胞GM-CSF表达,但孕酮下调子宫内膜上皮细胞GM-CSF表达,且呈明显的时间剂效关系；雌二醇上调奶牛子宫内膜上皮细胞表达GM-CSF的作用受孕酮的拮抗。IFN-τ在基因水平上调奶牛子宫内膜上皮细胞表达GM-CSF,但在蛋白水平作用不显著。
【作者】刘相洋；
【导师】邓干臻；
【作者基本信息】华中农业大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】雌二醇；孕酮；IFN-τ；奶牛；GM-CSF；子宫内膜上皮细胞；

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