气单胞菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆、表达与定点突变研究

【摘要】L-瓜氨酸(L-citrulline)是人体尿素循环中的一种重要代谢产物,能够吸收并清除有害的自由基从而起到抗氧化的作用。瓜氨酸是由精氨酸脱亚胺酶(ArgininedeiminaseADIEC3.5.3.6)催化产生的。目前,生产L-瓜氨酸的方法主要有：发酵法,化学法,提取法和酶法。发酵法生产的缺点是L-瓜氨酸产率低。化学法生产的产品中含有L-瓜氨酸的旋光对映体D-瓜氨酸。提取法的生产工艺相对困难,产品很难纯化,因此成本比较高。酶法优点是生产条件温和,产品中无D型旋光对映体产生。酶法生产L-瓜氨酸是一种效率高,成本低的生产方法,将在瓜氨酸生产中起到重要作用。ADI将在未来瓜氨酸的生产中扮演重要的角色。本课题通过筛选得到一株产ADI的菌株,对该菌进行16SrRNA基因的序列分析,鉴定该菌属于Aeromonassp.。从中克隆精氨酸脱亚胺酶ADI的基因arc。该基因的全长有1221bp,起始密码子为ATG,终止子为TAA,GC含量为61.43%。ADI的基因arc编码406个氨基酸,ADI的分子量大小约为45.46kDa,等电点pI为6.17。通过SignalP4.1Server预测可知,该氨基酸的序列中没有信号肽。通过BLAST比对氨基酸序列分析发现,Aeromonassp的ADI与已报道的Pseudomonasplecoglossicida的ADI相似性最高,为46%。因此,本研究从Aeromonassp.中克隆到了较为新颖的ADI基因。将arc克隆到表达载体pGEX-6P-1上,构建重组质粒pGEX-6P-arc,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG的诱导,测定重组菌粗酶液的转化率,大小为30%。经纯化后得到纯酶ADI。对纯酶的酶学性质进行研究后发现,该酶的最适温度为55℃,最适pH为6.0,Km为0.66mmol/mL,最大反应速率Vmax为4.37μmol.mL-1.min-1,kcat为1.15s-1,kcat/Km为1.74mL/s-mmol。根据对相应的参考文献和精氨酸脱亚胺酶基因序列的综合分析,对精氨酸脱亚胺酶ADI的两个关键氨基酸残基M128,D404进行定点突变,获得ADI的突变株M128T,D404R。将突变株质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达与纯化,并对纯化获得的突变体蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变体M128T与野生型相比,最适pH由6.0升至6.5,接近生理pH。但是M128T,D404R的Km值,kcat值均有所下降,活性较野生型有所降低。根据实验结果分析推测,128和404位点可能位于ADI的催化中心或者附近,很可能是该催化中心的保守位点,间接说明了这两个位点在ADI的催化中起着十分重要的作用。具体机制还需要进一步结合晶体结构分析来解释。
【作者】冉诗；
【导师】刘子铎；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】精氨酸脱亚胺酶；气单胞菌；筛选；酶学性质；定向进化；

【参考文献】
[1]濮丽丽.苏州市小学校本教材开发的调查研究[D].苏州大学,课程与教学论,2014,硕士.
[2]葛雍.急剧变化环境下的边缘竞争战略[D].中国海洋大学,2004.
[3]王中浩.基于中、美、日三国FRP加固设计标准的钢筋混凝土梁生命周期评价[D].北京交通大学,2014.
[4]刘旖婧.框架理论下莎剧中多义词Blood的翻译[D].广西师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[5]曹诗怡.城市居住与商业空间结构演变相关性研究[D].湖南大学,建筑学,2012,硕士.
[6]张磊生.产业技术创新战略联盟利益分配研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.
[7]陈媛媛.地方政府债券融资：模式与规制[D].吉林大学,金融,2013,硕士.
[8]黄三雄,吴育连,唐成武,王耀,张良.两种不同微创方法治疗老年胆囊结石合并胆总管结石的疗效对比[J].中国老年学杂志,2014,24:6930-6932.
[9]王燕儿,郭大捷.金银花清咽液的工艺与含量测定研究[J].轻工科技,2014,10:24-25.
[10]顾先觉.SX地区二维地震资料重新解释的方法及地质成果[J].石油地球物理勘探,1996,S2:112-117+151.
[11]姚晖.手术导航系统中手术器械的视觉跟踪研究[D].吉林大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[12]查冬.高K栅介质Ge MOS电容特性与制备研究[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[13]苗翠霞.几类分批排序和在线排序问题的复杂性[D].曲阜师范大学,运筹学与控制论,2004,硕士.
[14]宋朋.线性光学器件和量子纠缠的研究[D].曲阜师范大学,理论物理,2004,硕士.
[15]黄耀华.滴灌施肥条件下NPK在紫色土中迁移分布规律研究[D].西南大学,土壤学,2014,硕士.
[16]董燕.基于Web的科研管理系统设计与实现[D].西安工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[17]赵丹青.对北京市三所小学体育校本课程情况的调查[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[18]郎芳.基于Django技术的自动化测试工具设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[19]肖明纲.玉米疯顶病病原菌检测和病害防治技术研究[D].中国农业科学院,植物病理,2004,硕士.
[20]万新霞.功能翻译理论指导下的复合型文本翻译[D].中国海洋大学,英语笔译（专业学位）,2014,硕士.
[21]王莉.低成本碳纳米管混杂多尺度复合材料的结构与性能[D].沈阳航空航天大学,2014.
[22]王哲.食管腺癌患者血液中外排小体微小RNA的研究[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[23]张宝琳,唐功友.受扰奇异摄动时滞组合大系统的近似最优控制[J].控制与决策,2007,11:1245-1249+1254.
[24]刘丹丹.基于词汇语义信息的中文关系抽取研究[D].苏州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[25]宋一民.国家皮划艇激流回旋队备战奥运会冬训力量训练研究[D].北京体育大学,运动训练,2013,硕士.
[26]孟慧娟.青岛地区中小学生泌尿生殖道解脲脲原体及人型支原体分子流行病学调查[D].青岛大学,皮肤病与性病学,2013,硕士.
[27]李华林.延安时期毛泽东的马克思主义大众化思想研究[D].西南大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[28]周会琴.医学专科院校校园文化建设实证研究[D].安徽大学,公共管理,2012,硕士.
[29]桑莹莹.来华留学生汉语称呼语习得分析[D].安徽大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[30]李春梅,范全润.空间数据挖掘及其在地理信息系统中的应用[J].楚雄师范学院学报,2005,03:6-10.
[31]陈佳锋.浏阳市传统烟草农业与现代烟草农业比较分析[D].湖南农业大学,农业推广,2012,硕士.
[32]张中有.中国消防体制的困境及对策研究[D].吉林大学,公共管理,2014,硕士.
[33]颜春晖.跨文化交际中的新闻英语翻译实践探讨[D].兰州大学,笔译（专业学位）,2013,硕士.
[34]孙宇.试论证据证明力[D].中国政法大学,诉讼法学,2004,硕士.
[35]赵蒙.司法实践中地方政府性债务的判决分析[D].西南政法大学,民商法（专业学位）,2012,硕士.
[36]丁强.一种新型安全计算机数据库更新机制的设计和实现[D].浙江大学,电子信息技术及仪器,2013,硕士.
[37]蔡丽.机动车交通事故损害赔偿归责比较研究[D].对外经济贸易大学,国际法学,2004,硕士.
[38]岳凯.油/水界面制备各向异性/树莓状/空心微球研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[39]唐文丹.几何的纯粹性与建筑的复杂性——以椭圆为例的研究[D].清华大学,建筑学,2003,硕士.
[40]汪国林.牵引供电系统跳闸原因分析[J].上海铁道科技.2007(01)
[41]桂亮.信号完整性研究及其在网络视频监控终端中的应用[D].浙江工业大学,2012.
[42]李文强.JCVM API的分析与设计[D].广东工业大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[43]董晏娜.论京剧《杜鹃山》的音乐创作—主要人物唱段、背景音乐及其配乐研究[D].中国戏曲学院,作曲与作曲技术理论,2013,硕士.
[44]赵永胜.通信室分集成行业同质化竞争的独特客户价值研究[D].北京邮电大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[45]杜丽红.社区高血压病患者五态人格及其生活方式的研究[D].北京中医药大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[46]彭玉楼,刘亚辉.利用决策树和聚类理论对XML文档数据挖掘的研究[J].株洲工学院学报,2005,04:29-31.
[47]杨青,郑应平.多项式族稳定性判定问题的多项式算法[J].自动化学报,1996,03:309-314.
[48]洪丹.微博对高校思想政治教育的影响研究[D].杭州电子科技大学,思想政治教育,2013,硕士.
[49]郑亚月.高中生物《稳态与环境》中“思考与讨论”栏目的再构建[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[50]郭小瑞.MicroPET/CT脑显像评价中西药治疗帕金森病模型鼠的疗效及对比研究[D].河北医科大学,影像医学与核医学,2014,硕士.