miR-652调控猪PYY基因以及PYY基因5’侧翼序列甲基化的研究

【摘要】采食量直接决定动物能够从环境中获得多少营养物质,它是评价动物营养物质需求和能量代谢的基础,而生理因素是影响动物采食量的最根本的因素。研究表明,在下丘脑食欲调控网络中有许多促进食欲和抑制食欲的调控因子,PYY就是其中之一。PYY在食欲和机体肥胖上面有重要的调控作用,动物减少采食后pYY的释放增加,显示食欲增强,并与肥胖呈负相关,对PYY的调控可能是机体控制食欲的重要途径。因此,本研究从PYY基因的表观遗传调控入手,电子克隆猪PYY基因,找寻能够引起PYY基因3’UTR潜在miRNA结合位点发生改变的SNP,并加以验证,同时探讨了PYY基因5’侧翼序列的甲基化状态,初步解析了miR-652与PYY之间的作用关系以及PYY甲基化状态,为PYY调控猪采食量进一步提供了理论基础,并为利用PYY进行采食量控制的具体应用提供素材。取得的结果如下：1.q-PCR组织表达谱结果显示：PYY基因在大白和梅山猪胃、十二指肠中的表达量明显比在脑、心等组织中要高,并且梅山猪各组织中PYY的表达量均高于大白猪；梅山30日龄、75日龄和275日龄在十二指肠和胃中PYY基因呈现逐渐升高的表达趋势,并且十二指肠中的表达量高于同期胃中的表达；大白猪3日龄、30日龄和120日龄十二指肠和胃PYY基因表达均先升高后降低,并且在十二指肠中也高于同期胃中的表达量。2.通过分子克隆获得大白和梅山猪PYY基因包括3’UTR在内的侧翼序列892bp,序列比对共检测到8个变异位点。通过对57个个体进行测序发现,变异比较稳定的SNP有：C137T、C146T以及C169T,并且均出现CC、CT、TT三种基因型。此外,分别统计了这三个位点的基因型频率和等位基因频率。其中第146位基因型频率分别为29.41%、11.77%、58.82%,等位基因C、T频率为35.29%、64.71%。3.利用生物学信息软件预测得到两个突变位点(C146T和C169T)存在不同的miRNA与PYY基因结合,分别为miR-652、miR-4339。为进一步验证所预测的miRNA与PYY基因的关系,我们构建了荧光素表达载体,转染细胞后分析得到miR-4339与PYY基因之间不存在靶向关系；从mRNA水平和蛋白水平验证miR-652对靶基因起负调控作用,表明二者之间存在靶向关系,并且,T146C的突变导致靶向关系消失,推断该位点可能导致了PYY基因在梅山猪和大白猪之间的表达差异。4.利用在线软件预测猪PYY基因5’侧翼存在CpG岛,故运用重亚硫酸盐测序法对梅山和大白猪十二指肠以及胃组织中的DNA特异性扩增后测序分析,结果显示不同日龄和不同组织中猪PYY基因5’侧翼甲基化状态不同,和组织表达谱分析结果具有相反趋势。综合以上结果我们推断,PYY的表达在各个组织和不同发育阶段均表现差异；5’侧翼DNA甲基化比率不同可能是PYY在不同发育阶段表达差异的重要原因；试验还发现miR-652参与PYY的转录后调控,并且在种子序列中发现SNP(C146T)影响了这种相互结合。
【作者】宗泽谕；
【导师】任竹青；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】猪；PYY；组织表达谱；SNP；miRNA；甲基化；

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