嗜冷杆菌Psychrobacter sp.的冷活性、耐盐酯酶基因的克隆、蛋白表达及其酶学性质研究

【摘要】酯酶（Esterase,EC3.1.1.X）是具有重要工业价值的生物催化剂之一,可以水解酯类底物产生酸类和醇类物质,也可以催化逆反应合成各种酯类,因此在食品、药物、农业、化工等多种领域广泛研究和应用。冷活性酯酶具有在低温下保持高的催化效率,温度升高时不稳定的特点,能够满足一些特殊的工业生产要求（如低温）,达到高效催化、节省能源、热不稳定物质合成等目标。本研究筛选到两株活性较高,可以产冷活性酯酶的嗜冷菌株,分别是嗜冷杆菌（Psychrobactersp.）和太平洋嗜冷杆菌（Psychrobacterpacificensis）。分别在大肠杆菌EscherichiacoliDH5a中构建它们的基因组文库,通过添加有酯酶筛选底物三丁酸甘油酯的固体Luria-Bertani培养基筛选基因组文库,得到两个可以产透明圈的重组大肠杆菌克隆子。通过插入片段测序、生物信息学分析,鉴定出两个酯酶基因,分别是来自Psychrobactersp.的酯酶基因est12和Psychrobacterpacificensis的酯酶基因est10。基因est10（Genbankaccessionno.KC291403）全长672个碱基,编码223个氨基酸,分子质量为24,647道尔顿,对应的酯酶Est10与来自嗜冷杆菌Psychrobactersp.PAMC2119的一个羧酸酯酶（NCBI参考序列为WP010199455.1）的同源性最高（92%）；基因est12（Genbankaccessionno.KF313138）含990个碱基对,编码329个氨基酸,分子质量为35,150道尔顿,对应的酯酶Est12与来自嗜冷杆菌Psychrobactersp.PAMC211的一个酯酶（NCBI参考序列为WP010200623.1）的同源性最高（77%）酯酶Est10和Est12在大肠杆菌EscherichiacoliBL21（DE3）中诱导、表达和纯化后,检测其酶学性质。在不同侧链长度的对硝基苯酯类底物中,Est10对侧链四碳底物对硝基苯丁酸酯（p-nitrophenylbutyrate）活性最高,对十六碳的对硝基苯棕榈酸酯（p-nitrophenylpalmitate）没有活性。酯酶Est10最适反应温度25℃,最适反应pH7.5,在低温0℃能保持55%的活性；Est10在室温比较稳定,在40℃孵育2小时后仍能保持80%以上的活性。1mmol/L低浓度Zn2+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、尿素和EDTA可以轻微地提高Est10活性,而同浓度的DTT和PMSF分别轻微和完全抑制其活性。增加NaCl浓度可以提高酯酶Est10的活性（2mol/LNaCl溶液中,活性提高至143.2%）和稳定性（在5mol/LNaCl溶液中孵育6.5小时后,活性提高到126.4%）,说明Est10耐盐的性质。体积比为0.05%和0.1%的去污剂tween20、tween80、TritonX-100和CHAPS均可以提高Est10的活性和稳定性,而SDS和CTAB则相反。同时,Est10和30%的有机溶剂包括甲醇、DMSO.乙二醇孵育后仍保持较好活性,和30%异丙醇、乙醇、正丁醇和乙腈孵育后活性很低。进化树分析表明酯酶Est112可能属于一个新的酯酶家族。酯酶Est12最适底物同样为p-nitrophenylbutyrate,最适反应pH7.5,最适反应温度为35℃,在0℃可以保持41%的活性,在40℃以上时不稳定,体现了冷活性的特点。同时,Est12也是个耐盐酶,反应体系中NaCl浓度从0mol/L提高到4.5mol/L时,其米氏常数Km从0.069mmol/L降低至0.033mmol/L,催化常数kcat从4.20s-1升至9.21s-1,使催化效率kcat/Km从60.72s-1·mM-1升至276.31s-1·mM-1；同样,在0-4.5mol/LNaCl溶液中处理24小时后,酯酶Est12依然非常稳定。同时,酯酶Est12对在一些有机溶剂和去污剂存在时,也具有很好的活性和稳定性。本研究得到了两个新型的冷活性、耐盐,并对有机溶剂和去污剂具有一定耐受的酯酶,它们在一些极端工业生产加工条件（低温、高盐、有机合成等）中具有潜在应用价值。
【作者】吴国杰；
【导师】刘子铎；
【作者基本信息】华中农业大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】酯酶；嗜冷杆菌；冷活性；耐盐；工业生产；

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