猪APOA2和SEPW1基因的转录调控分析

【摘要】猪,是我们获取动物蛋白质的主要来源。猪肉品质好坏直接影响着口感。随着生活水平的提高,人们对猪肉品质的要求也有所提高。因此,通过分子育种的方法改善猪的肉质性状是当前比较热门的一项研究课题。为此,我们在分子水平上对猪的脂肪相关基因APOA2和肌肉相关基因SEPW1进行了相关性研究,主要集中在基因的启动子区域进行转录调控分析。所得的结果如下所述：(1)猪APOA2和SEPW1基因在猪不同组织中表达情况的研究。主要采用实时定量PCR的方法进行检测,并建立了组织表达谱。结果为：猪APOA2基因主要在肝脏中表达,并且表达量很高；在脂肪中也有微量的表达;在其它组织中表达量极低,可忽略不计。猪SEPW1基因在各个组织中均有不同程度的表达,而在心脏和腓肠肌组织中表达量最高,在脾脏中表达量最低。(2)猪APOA2和SEPW1基因5’侧翼调控序列的克隆。我们参照NCBI上提供的基因5’侧翼调控序列进行引物设计,以猪基因组DNA为模板,克隆了猪APOA2基因1919bp和SEPW1基因1993bp的序列。序列克隆结果与NCBI上提供的序列进行比对,相似度均达到99%。(3)猪SEPW1基因启动子CpG岛甲基化情况研究。通过MethPrimer软件预测猪APOA2和SEPW1基因启动子区域的CpG岛,在APOA2基因启动子序列中没有发现CpG岛,而SEPW1基因启动子序列中有3个CpG岛。对位于SEPW1基因启动子的-751–483区域的CpG岛进行了克隆分析,甲基化水平均较低。(4)启动子活性研究。我们构建了APOA2基因启动子区域的7个不同长度的双荧光素酶报告基因载体,以及SEPW1基因启动子区域的6个不同长度的双荧光素酶报告基因载体。转染细胞,检测荧光活性,发现APOA2基因启动子的-208–21、-813–209这两个区域分别能够独立起始转录,SEPW1基因核心启动子位于-443-+27区域内。(5)转录因子结合位点的分析预测。我们对可能含有正调控元件的区域继续进行缺失分析,并结合生物信息学方法,得出在APOA2基因-601–565区域内含有GATA1转录因子结合位点,在SEPW1基因-378–306区域内含有SP1结合位点。(6)我们突变了GATA1结合位点的3个碱基,转染PK细胞,发现突变后的片段活性显著低于未突变片段的活性；转染C2C12细胞时,突变后的片段与原片段相比,活性极显著降低。对于SP1的结合位点,我们突变了单个碱基,转染PK细胞,发现突变载体的活性极显著降低。(7)分别将GATA1和SP1的真核超表达载体和猪APOA2和SEPW1基因启动子缺失载体共同转染PK细胞,得出转录因子超表达后可以显著提高启动子活性。(8)首先,将猪SP1的RNA干扰片段转染PK细胞,定量检测它对转录因子SP1的干扰情况,发现能够显著性的降低SP1的表达量。然后,将小的RNA干扰片段与缺失载体共同转染细胞,检测启动子缺失载体活性,发现SP1的表达量降低均可以显著降低启动子活性。
【作者】李鑫；
【导师】熊远著；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】猪；APOA2；SEPW1；启动子；转录因子；甲基化；

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