调控DNMT1对胎牛成纤维细胞细胞增殖、周期、凋亡的影响

【摘要】体细胞核移植技术作为一项发展日益成熟的技术,在很多领域都显示出了广阔的应用前景。但是,体细胞核移植技术的效率很低,这也成为了限制其发展的最大障碍,其中表观遗传修饰异常被认为是导致体细胞核移植效率低的主要原因之一。DNMT1在维持基因组甲基化的过程中发挥着重要的作用,其对克隆胚胎发育相关基因的正常表达十分重要。本研究使用不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理胎牛成纤维细胞,并设计三条不同的DNMT1特异性siRNA片段转染胎牛成纤维细胞,研究不同处理对胎牛成纤维细胞的增殖能力、细胞活力、周期、凋亡的影响,并检测DNMT1基因在胎牛成纤维细胞中的表达水平,从而获得不同处理对胎牛成纤维细的影响,为DNMT1的研究以及核移植供体细胞的选择提供参考。主要研究结果如下：1.不同浓度5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胎牛成纤维细胞的增殖活力、周期、凋亡以及DNMT1表达水平的影响。选用0、0.01、0.1、0.5、1μmol/L的5-aza-CdR处理胎牛成纤维细胞。结果显示：经96h连续测定发现,与空白对照组相比,实验组细胞的增殖速度和细胞活力随处理时间的延长而下降,且随着5-aza-CdR浓度的增高,其对胎牛成纤维细胞增殖的抑制作用越显著,细胞活力下降越快；24-96h,较高浓度(0.5、1μmol/L)的5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用(p<0.05),且在48-72h细胞活力显著下降(p<0.05)。24-72h,0.5、1μmol/L的5-iza-CdR对胎牛成纤维细胞的G0/G1期具有显著的抑制作用(p<0.05)；除了0.01μmol/L的5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞的凋亡影响不显著以外,其余各组与对照组相比均对胎牛成纤维细胞的凋亡有显著影响(p<0.05)。48h,经0.5、1μmol/L的5-aza-CdR处理后,胎牛成纤维细胞中DNMT1的表达水平分别下降了14%和24%。综上所述,较高浓度的5-aza-CdR虽然可以下调DNMT1的表达水平,但是却对细胞的生长不利,只有低于0.1μmol/L的5-aza-CdR适宜用作处理胎牛成纤维细胞。2.不同Ⅰ)NMT1特异性siRNA片段对胎牛成纤维细胞的增殖活力、周期、凋亡以及DNMT1表达水平的影响。设计三条不同的DNMT1特异性siRNA片段转染胎牛成纤维细胞。结果显示：DNMTl-siRNA3对DNMT1基因表达的抑制效果最好,在24h、48h、72h均与对照组有极显著差异(p<0.01),且在48h时,DNMT1-siRNA3对DNMT1表达的抑制水平达到了近80%；与对照组相比,ⅠDNMT1-siRNA3对胎牛成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用(p<0.05),且细胞活力显著下降(p<0.05)。DNMT1-siRNA3与对照组相比可使细胞阻抑在G0/G1期(p<0.05)。DNMT1-siRNA3可显著诱导细胞凋亡(p<0.05)。因而,下调DNMT1可导致细胞增殖异常,活力下降,细胞凋亡增加,细胞周期阻滞。
【作者】王文璐；
【导师】易建明；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】牛；胎牛成纤维细胞；DNMT1；5-氮杂-2’-脱氧胞苷；RNAi；siRNA；

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