耐冷及嗜盐木聚糖酶的基因克隆、表达、酶学性质及突变研究

【摘要】半纤维素是除了纤维素以外最为丰富的多糖,也是自然界中的第二大可再生资源,所以人们对它的主要组成成分木聚糖的降解有着广泛的兴趣。降解木聚糖的最主要的糖苷水解酶是内切-β-1,4-木聚糖酶,它可以降解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键,产生低聚寡糖和木糖。木聚糖酶在工业上,如饲料、造纸、食品、能源、纺织等方面的应用都已经非常的广泛。为了满足不同的工业需求,发掘和研究具有不同嗜极性质(嗜碱、嗜酸、嗜冷、嗜盐、嗜热等等)的木聚糖酶显得尤为重要。本研究从一株来自海洋沉积物中的深海王祖农菌Zunongwangiaprofunda中,利用特异性引物克隆了一木聚糖酶基因xynA,并成功的将其在大肠杆菌E.coli(DE3)中进行诱导表达,经纯化后进行了酶学性质的分析。同时针对该木聚糖酶的特点,利用随机突变技术进行了定向进化改造。所取得的研究进展如下：1.利用PCR技术从Zunongwangiaprofunda克隆得到的内切-β-1,4-木聚糖酶基因xynA全长1125bp,共编码374个氨基酸,蛋白分子量大小是43.7kDa。XynA的等电点pI是6.632,GC含量是38.81%。经预测该木聚糖酶没有信号肽。通过BLAST比对,XynA属于糖苷水解酶第10家族,催化氨基酸残基是Glu169和Glu276。在已报道的木聚糖酶中,XynA最高相似性为42.78%。将XynA在大肠杆菌E.coli(DE3)中诱导表达,经纯化后分析木聚糖酶的酶学性质。XynA的最适pH是6.5,最适温度30℃,在0℃和5℃的低温仍分别可以保持15%和32%的活性。XynA不仅仅是一个冷活性的木聚糖酶,而且是一个耐盐的木聚糖酶。NaCl可以大大的提高酶的活性并增强酶的热稳定性。XynA的最适盐浓度是3.0mol/LNaCl,表现出最大激活活性191%,而且在5.0mol/LNaCl时,仍可以保持100%的活性。以1.0%山毛榉木聚糖为底物时,在有3.0mol/LNaCl存在时,XynA的Vax、Km、Kcat、kcat/Km分别由无NaCl存在时的0.05291mg/mL/min、2.98mg/mL、47.26/s、15.87mL/mg/s变成了0.03459mg/mL/min、1.15mg/mL、80.33/s、69.91mL/mg/s。在热稳定性方面,与没有NaCl存在时相比,3.0mol/L的NaCl使XynA在45℃孵育1h后的活性由8%提升到了55%,大大增强了木聚糖酶的热稳定性。这可能是第一个报道的在如此高浓度(3.0mol/L-5.0mol/L)的NaCl还可保持高活性的耐冷木聚糖酶。这一性质使得该木聚糖酶在食品以及从海藻中生产生物乙醇等方面具有潜在的应用价值。2.针对木聚糖酶XynA高耐盐性这一特点,欲使其该特点更加的突出,利用易错PCR技术构建了随机突变库,并针对性的在筛选底物中添加3.5mol/L的NaCl。从约7000个突变体中成功的筛选到一株突变体XynA-JD27,氨基酸序列比较后发现,在其C末端比野生型的少了27个氨基酸。突变株的最适pH仍是6.5,与野生型的一样。但是最适温度降到了25℃,并且在5℃可以保持50%的活性,而在稍高的温度条件下的活性没有野生型的高。最适盐浓度提升到3.5mol/LNaCl,并且在1.0mol/L-5.0mol/LNaCl范围内都可保持148%以上的活性,较野生型的盐激活作用有了很大的提高。在以1%的山毛榉为底物时,XynA-JD27的Vmax、Km、kcat和kcat/Km分别是0.08288mg/mL/min、3.86mg/mL、69.92/s和18.11mL/mg/s。在加入3.5mol/LNaCl后,XynA-JD27的Vmax、Km、kcat和kcat/Km分别变成了0.0645mg/mL/min、1.51mg/mL、108.9/s和72.12mL/mg/so这说明NaCl可以降低该突变木聚糖酶的反应速率,但是可以增强木聚糖酶与底物的亲和力,另外C末端对木聚糖酶的耐冷性和耐盐性都有一定的作用,这为该酶结构与功能研究奠定了基础。
【作者】刘晓爽；
【导师】刘子铎；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】木聚糖酶；适冷性；耐盐性；深海王祖农菌；定向进化；

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