蛹虫草多糖的发酵条件优化、结构及抗氧化活性研究

【摘要】蛹虫草(Cordycepsmilitaris)是虫草属的模式种,具有广泛的生物活性和药食用价值,多糖(polysaccharides)是蛹虫草的重要活性成分之一。本研究通过单因素实验、响应面法对蛹虫草液体发酵生产多糖的最佳发酵条件进行探索,对蛹虫草液体发酵产生的胞内多糖和胞外多糖分别进行提取、分离、纯化及基本理化性质分析,并进一步对纯化后的蛹虫草胞内多糖和胞外多糖的结构及体外抗氧化活性进行分析,为蛹虫草液体发酵的工业化生产奠定了理论基础,也为蛹虫草多糖的开发、应用提供了科学依据。主要研究结果如下：1.本研究以蛹虫草BYB-08(Cordycepsmilitaris,BYB-08)为出发菌株,通过单因素法筛选出影响蛹虫草液体发酵产多糖的最适培养基组分及发酵条件,然后在单因素实验的基础上运用Plackett-Burman因子设计实验,成功筛选出3个显著性因素,即蔗糖、酵母浸出粉和KH2PO4,运用Box-Benhnken中心组合实验设计得到蛹虫草产多糖的最佳发酵条件为：蔗糖6.41%、酵母浸出粉3.79%、KH2PO40.072%、温度25℃、发酵时间6d、转速150r/min、接种量10%、装液量100mL/250mL,验证实验测得总多糖含量达3.19g/L,这与Box-Benhnken中心组合实验设计模型的预测值3.23g/L较为接近,说明该模型准确可靠,拟合性良好。2.采用超声波辅助提取蛹虫草液体发酵产生的胞内多糖,水提醇沉法提取胞外多糖,经脱蛋白、透析等处理分别得到胞内粗多糖(Intracellularpolysaccharides,IPS)和胞外粗多糖(Exopolysaccharides,EPS),然后采用DEAE-cellulose-52和SepharoseCL-6B对IPS及EPS进一步分离纯化。经紫外光谱法、比旋度法及凝胶渗透色谱法对纯化后的胞内多糖IPS-3和胞外多糖EPS-3进行纯度鉴定,紫外光谱法结果显示IPS-3和EPS-3为不含核酸的均一多糖；比旋度法和凝胶渗透色谱法结果也表明IPS-3和EPS-3均为均一多糖组分；同时测得IPS-3和EPS-3的平均分子量Mw分别为67,920Da和37,350Da,且均含有较高含量的多糖、糖醛酸以及少量糖蛋白质。采用红外光谱(IR)、气相色谱(GC)对纯化后的蛹虫草多糖初级结构进行表征,结果表明：IPS-3和EPS-3的红外图谱相似,都具有多糖的特征吸收峰,IPS-3既有α-糖苷键构型又有β-糖苷键构型,同时含有β-D-甘露糖,而EPS-3在811cm-1、852cm-1有吸收峰,表明EPS-3存在含有α-糖苷键构型的吡喃甘露糖；气相色谱结果显示IPS-3和EPS-3具有相同的单糖组成,即甘露糖、葡萄糖和半乳糖,且均不含鼠李糖、阿拉伯糖和木糖,IPS-3的单糖组成及分子摩尔比为：D-甘露糖：D-半乳糖：D-葡萄糖=4.58：3.85：1.0；EPS-3的单糖组成及分子摩尔比为：D-甘露糖：D-葡萄糖：D-半乳糖=2.66：8.88：1.0。3.通过刚果红实验、粒度分布和紫外光谱分析对IPS-3和EPS-3多糖溶液的分子链构象进行研究,结果显示IPS-3和EPS-3的多糖溶液均不能与刚果红形成络合物,不具有三股螺旋结构,而是无规线团的分子链构象；不同浓度多糖溶液(0.01、1.0mg/mL)、放置时间(0、24h)对IPS-3和EPS-3粒度分布变化显示,随多糖溶液浓度增大和放置时间增加,多糖分子间相互缠绕并产生聚集,从而形成不同的空间构象,使IPS-3和EPS-3的平均粒径逐渐增大,粒度分散指数也发生了一定的变化。紫外光谱分析结果显示温度和金属离子对蛹虫草多糖的构象影响不大,而pH、尿素和二甲亚砜能破坏IPS-3和EPS-3分子内或分子间的氢键,使多糖分子的不对称性增强,从而对多糖的构象产生影响。4.扫描电镜显示IPS-3和EPS-3紧密聚集,呈无规则交叉的链状网络结构,存在分支并表现出一定的柔顺性,同时IPS-3和EPS-3的固态表观形貌还存在一定的差异；X-射线衍射进一步证实IPS-3和EPS-3均为无定形态；差式扫描量热仪对IPS-3和EPS-3的热特性分析结果显示,IPS-3和EPS-3的玻璃化温度分别为55.6℃、143.8℃,且在高温条件下可发生吸热和放热反应。5.以DPPH自由基、·OH、O2·-的清除能力、Fe2+螯合能力以及总还原能力为指标,对蛹虫草多糖IPS-3和EPS-3的体外抗氧化活性进行对比分析,结果表明：IPS-3和EPS-3对DPPH自由基都具有良好的清除效果,同时具有清除·OH、O2·-和螯合Fe2+的能力,也具有一定的总还原能力,但IPS-3和EPS-3的抗氧化活性存在一定的差异。
【作者】叶文姣；
【导师】冯武；
【作者基本信息】华中农业大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】蛹虫草；液体发酵；多糖；纯化；结构；抗氧化；

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