鸡ERα基因启动子的活性分析及其剪切体的时空表达研究

【摘要】禽类性别分化和性腺发育一直是禽类发育生物学研究的热点,但具体的性别分化及性腺发育的调控机制还有待进一步研究。研究发现与生殖系统发育及其功能维持密切相关的雌激素受体基因ERa在鸡性别决定早期性腺发育中有重要作用。已有研究表明ERa基因具有多个启动子,且不同启动子的转录产物不同(即存在不同剪切体),本研究首先拟对ERa基因5’上游区域进行研究,找出多个启动子的活性差异,在此基础上研究单个启动子调控的选择性剪切变体在鸡胚发育期及成年开产期不同组织中的表达差异,并与多个启动子调控的ERa总表达进行比对,探究二者之间的关系。实验采用双荧光素酶报告基因系统的方法,对构建的ERa基因启动子缺失片段进行启动子活性检测；用半定量RT-PCR的方法对剪切体和ERa的表达进行定量分析。具体结果如下：1、用3种细胞对含启动子缺失片段的双荧光素酶报告载体进行转染实验并进行启动子活性检测,发现DF1细胞的转染实验未检测出启动子活性,PK15和Hela细胞的转染实验检测出启动子活性差异,活性依次为ERaPF1(+52～+216)﹥ERαPF3(-238～+216)﹥ERαPF4(-403～+216)>﹥ERαPF2(-65～+216)>﹥ERαPF5(-2125～+216),初步认为双荧光素酶报告载体具有细胞特异性,另外ERa基因启动子活性差异可能与基因调控通路中多种转录因子或者启动子之间的相互作用有关。2、通过对不同胚龄(E10.5、E12.5、E14.5、E16.5、E18.5)鸡胚及6月龄成年鸡多种组织中C启动子转录的C剪切体的半定量检测,发现C剪切体具有组织特异性,只在肝脏组织中表达,且C剪切体的表达呈现出发育时期特异性及性别差异,另外在E14.5雄性胚胎肝组织中存在某种因子引起C剪切体的表达下调,这可能与启动子的表观修饰或者其他因素有关。3、通过对肝脏组织中多启动子调控的ERa总表达的半定量检测,发现6月龄成年鸡的两性肝脏组织中ERa的表达呈极显著差异,而胚胎期无差异,推测雌雄肝脏中的ERa差异表达极有可能与开产母鸡体内肝脏中蛋黄蛋白等的合成有关。4、通过与肝脏中ERa的表达进行对比,发现当雌雄两性间C剪切体表达为雌性大于雄性时,ERa表达则为雌性小于雄性,反之亦然。可以初步推测在雌雄两性间C剪切体表达与ERa的表达呈负相关,即C启动子与ERa的多启动子负相关。5、通过对6月龄成年鸡多种组织中ERa及其D启动子调控的D剪切体的半定量检测,发现ERa及其D剪切体在所测组织中均有表达,输卵管中ERa表达大于输精管,而D剪切体的表达小于输精管,初步推测在6月龄成年母鸡体内出现了某种调控机制对启动子D进行了负调控,使得D剪切体在输卵管中的表达量下降,但是由于ERa具有多个启动子,因此ERa表达量未受影响。6、通过对5个时期雌雄两性鸡胚组织中ERa及其D剪切体的半定量检测,发现二者在性腺中的表达量最高。与另外几种组织相比,肝脏中ERa的表达水平相对较高,D剪切体的表达水平相对较低。初步推测D启动子与鸡胚发育期性腺中ERa的表达正相关,而与肝脏中ERa的表达负相关。
【作者】徐婷婷；
【导师】龚炎长；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】鸡；ERα基因；剪切体；启动子；双荧光素酶报告基因；半定量RT-PCR；

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