纳米几丁质酶的制备及对苏云金芽胞杆菌杀虫的增效作用

【摘要】苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种在其生长代谢过程中能够产生多种杀虫晶体蛋白(ICPs)的产芽胞细菌,现已成为全球范围内防控靶标害虫的重要细菌杀虫剂之一。Bt杀虫剂具有杀虫特异性强、对人畜及非靶标昆虫无毒副作用和便于生产等诸多优点,但是,传统的Bt制剂在使用过程中存在杀虫迟缓、稳定性差、容易受到紫外线等环境因素影响而导致持效期短等问题。本研究通过利用纳米Si02固定几丁质酶制备相应的纳米几丁质酶、表达纯化高活性突变几丁质酶和构建表面展示几丁质酶的重组苏云金芽胞杆菌菌株等,对纳米几丁质酶、纯化高活性几丁质酶和表面展示几丁质酶对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的杀虫增效效果进行了研究。对表面含有羟基的纳米Si02(纳米SiO2-OH)分别进行氨基化、羧基化和醛基化修饰,制备了相应的纳米SiO2-NH2、纳米SiO2-COOH和纳米SiO2-CHO材料,经SEM观测、测定纳米颗粒粒径和用红外光谱表征确证表面基团的改性特性后,进一步采用共价结合固定几丁质酶的方式,制备了纳米SiO2-CH=N-Chi9602和纳米SiO2-CONH-Chi9602;采用静电吸附固定几丁质酶的方式,制备了纳米SiO2-COOH/Chi9602、纳米SiO2-NH2/Chi9602和纳米SiO2-OH/Chi9602。经测定,纳米SiO2-CH=N-Chi9602的固定化率可达到92%,但酶比活力仅为原有酶的3%；纳米SiO2-CONH-Chi9602的固定化率为87.7%,酶比活力为原酶的12.8%；纳米SiO2-COOH/Chi9602的固定化率为29.5%,酶比活力为原酶的93.8%；纳米SiO2-NH2/Chi9602固定化率为80.2%,酶比活力为原酶的94%；纳米SiO2-OH/Chi9602的固定化率为55.8%,酶比活力为原酶的44.8%。由此确定纳米SiO2-NH2/Chi9602为优化制备的纳米几丁质酶材料。对纳米SiO2-NH2/Chi9602的热稳定性和pH稳定性进行了测定,结果表明纳米SiO2-NH2/Chi9602比游离几丁质酶具有更高的热稳定性和更宽pH值适应性。在紫外线照射稳定性上,纳米SiO2-NH2/Chi9602在试验条件下的酶比活力半衰期为23.4min,游离几丁质酶的酶比活力半衰期为15.1mmin,显示纳米SiO2-NH2/Chi9602具有更强的耐紫外辐射性能。以秀丽隐杆线虫为生测虫体,对纳米SiO2-NH2/Chi9602与苏云金芽胞杆菌YBT-020制剂复配混合物的杀虫效果进行了比较测定,结果显示纳米SiO2-NH2/Chi9602复配后的总致死率增加约30%。对另一杀线虫菌株YBT-032也获得了类似的试验结果。尽管与游离几丁质酶相比,纳米SiO2-NH2/Chi9602仅显示有限的增加效果,但在致死时间上后者所用时间更少,表现出更快速的致死效果。观测到纳米几丁质酶在线虫虫体内具有更广和更大量的分布,也从另一层面支持纳米SiO2-NH2/Chi9602的增效杀虫活性。利用高酶活性的突变几丁质酶Chi9602W50A与YBT-020复配进行了杀线虫效果测定,结果证实该酶对秀丽隐杆线虫的致死率明显高于对照的野生型几丁质酶Chi9602。而在与杀棉铃虫活性的YBT-1520制剂复配后,半致死浓度LC50为4.238μg·mL-1,比野生型Chi9602复配混合物的半致死浓度降低23.8%,表现出更显著的杀棉铃虫增效作用。在此基础上,构建了表面展示突变型Chi9602W50A的苏云金芽胞杆菌工程菌MB461菌株。原宿主菌YBT-881活性和工程菌MB461均未对秀丽隐杆线虫显示杀虫活性,反映出几丁质酶仅有增效效果、无新增杀虫活性。用工程菌MB461与杀线虫活性细菌YBT-020制剂的复配表现出增效杀虫效果,进一步证实了几丁质酶的这一活性。
【作者】秦旭；
【导师】李林；
【作者基本信息】华中农业大学，发酵工程，2014，硕士
【关键词】苏云金芽胞杆菌；几丁质酶；纳米SiO2；纳米几丁质酶；增效杀虫活性；秀丽隐杆线虫；棉铃虫；

【参考文献】
[1]白玉.表皮松解性角化过度型鱼鳞病KRT1基因突变的研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[2]赵晗.避暑山庄非物质文化遗产初探[D].华中师范大学,专门史,2013,硕士.
[3]张海进.近地层大气O_3浓度升高对稻田生态系统微量元素的影响[D].扬州大学,环境科学,2011,硕士.
[4]田小玲.近代湖湘老学研究[D].华中师范大学,专门史,2013,硕士.
[5]刘明泉,王彬,李龙义,张文钦.黄金矿山地下开采单中段生产日过2000t的实践[J].有色金属(矿山部分).2006(02)
[6]张译心.Leber遗传性视神经病变临床特点及光学相干断层扫描特点[D].中国人民解放军医学院,眼科学,2013,硕士.
[7]王彬,周晓庆,李笑诚,陈志敏,贺春英,吴谊群.氨基金属酞菁功能化修饰氧化石墨烯复合材料的制备及氨敏性研究[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第16分会：π-共轭材料[C].中国化学会:,2014:1.
[8]徐瑛.成都液体空分项目的进度管理[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[9]单福彬.基于顾客价值和顾客忠诚的客户关系管理研究[D].广西大学,2005.
[10]胡智勇.生态批评视角下解读《马语者》[D].河北师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[11]刘艳.自发性高血压大鼠胸主动脉重建与可能机制及血府逐瘀汤的干预作用[D].浙江中医学院,中医内科学,2003,硕士.
[12]沈海玉.苏皖地区禽白血病流行病学调查及其净化初步研究[D].扬州大学,预防兽医学,2011,硕士.
[13]张凯军,梁循.一种改进的显性多核支持向量机[J].自动化学报,2014,10:2288-2294.
[14]任彦洁.沪杭创意产业园区景观研究[D].浙江大学,2008.
[15]尹欣.平面设计中国际化与民族性的研究[D].华中师范大学,设计学,2013,硕士.
[16]高欢.传统民居的气候适应性研究[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[17]邹志梅.环境税法律制度变迁研究[D].山东师范大学,环境与资源保护法学,2013,硕士.
[18]郑涛.浮筏隔振系统振动特性分析与主动控制研究[D].南京航空航天大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[19]汪炳柱,徐世浙,刘保华,阎汉杰,张建世,刘新华.多次插值切割法分场的一个实例[J].石油地球物理勘探,1997,03:431-438+462.
[20]王乐.中国保险集团偿付能力监管研究[D].辽宁大学,保险学,2012,硕士.
[21]董凤芝.大型国有企业实施CRM对策研究[D].吉林大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[22]潘丁.人膝骨关节炎滑液蛋白质组学研究及国人骨关节炎流行病学Meta分析[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[23]潘树明.烧结SmCo5合金750℃回火效应与内禀矫顽力[J].中国有色金属学报.1992(01)
[24]汪国华.吴江乡镇企业发展研究[D].苏州大学,中国近现代史,2003,硕士.
[25]吴斌.商业智能的技术与实践[J].中国计算机用户,2004,02:46-47.
[26]潘丽鹏.Translation of Chinese Euphemism Based on Skopostheorie[D].西安外国语大学,翻译,2014,硕士.
[27]王鲁迪.多党合作视域下参政党建设研究[D].武汉纺织大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[28]董雪梅,徐怀民,胡婷婷,陈扬,李静,贺陆明.层序约束地震储层预测技术在岩性圈闭识别中的应用[J].石油地球物理勘探,2012,S1:84-90+167+162.
[29]施永.新型相位噪声测量方法[D].西安电子科技大学,测试计量技术及仪器,2011,硕士.
[30]覃立力.农业产业中的一体化合作[D].华中师范大学,社会学,2014,硕士.
[31]王天真,郝瑞吉,汤天浩,Ben■tMOMEUX,LionelHAMEL,GuillaumeEUDELINE.一种基于数据挖掘的GIS及在航海中的应用[J].中国航海,2003,03:3-6.
[32]李磊.顾及形状和邻近关系的水体分层细分类技术研究[D].吉林大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[33]陈思齐.并行IDS流量分发设备控制软件的设计与实现[D].国防科学技术大学,软件工程,2012,硕士.
[34]雷开臣.拒水阻燃水性聚氨酯的制备及性能评价[D].武汉纺织大学,纺织化学与染整工程,2013,硕士.
[35]张冬.糖尿病与原位大隐静脉病变的相关性研究[D].山东大学,外科学,2013,硕士.
[36]李晨.不同类别的大学生学习环境感知、人格特质对学业成就的影响研究[D].华中科技大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[37]李志先,石先明.计轴+双轨条无绝缘自动闭塞研究设计[J].铁道通信信号.2005(10)
[38]王瑞.论信贷资产证券化中投资者权益的保护[D].南京大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[39]杨金营.抗日战争时期中国共产党的民族政策转变研究[D].云南师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[40]何子波.基于无线传感器网络动态簇机制的目标跟踪和耗能优化方法研究[D].山东大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[41]HuangLili.朝善之路：艾丽斯·默多克小说《黑王子》的伦理学解读[D].西安外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[42]向萍.线索—目标物的关联在儿童空间再定向中的作用[D].西南大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[43]梁政.黑龙江农垦系统污水处理工程BOT项目盈利能力研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[44]曹雯静.国兰部分主栽品种遗传多样性及分子鉴定研究[D].华侨大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[45]王强.铜基形状记忆合金的相变内耗及其机制[D].合肥工业大学,材料科学与工程,2004,硕士.
[46]朱健.智能变电站电网安全稳定控制装置的采样值处理与研究[D].南京邮电大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[47]宋小玲,皇甫超河,强胜.抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动[J].植物生态学报,2007,04:729-737.
[48]刘刃.“红颊”草莓组培标准化与生物反应器扩繁及穴盘壮苗技术研究[D].浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[49]韩爽.不同时间饲喂辛伐他汀或依折麦布/辛伐他汀对家兔动脉粥样硬化病变的影响[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[50]张功震.民营科技企业技术创新环境研究[D].湖南大学,科学技术哲学,2003,硕士.