山羊耳尖成纤维细胞重编程为多能干细胞的研究

【摘要】2006年,诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells,iPSCs)被日本东京大学的Takahashi和Yamanaka发现,由于其与胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ES)存在相似的自我更新和分化潜能,且不涉及伦理问题。因此,在临床治疗等方面具有广阔的研究前景并迅速成为当前研究的热点。本试验以山羊为材料分离山羊耳尖成纤维细胞(Goatearfibroblast,GEF),并通过多顺反子慢病毒系统和可诱导慢病毒系统尝试重编程GEF为山羊iPS细胞,优化山羊iPS细胞的诱导方法。结果如下：1.通过组织块贴壁法成功分离得到GEF,通过酶消化法分离C57/BL6小鼠胚胎成纤维细胞(MouseEmbryonicFibroblast,MEF)。丝裂霉素C处理MEF和GEF,制备饲养层。2.慢病毒载体与包装载体共转293t细胞,进行慢病毒包装,48h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,收集慢病毒上清液并测定滴度。多顺反子慢病毒plentG-KOSM滴度为105～6TU/ml,用Millipore的100KD浓缩柱使其滴度达到106～7TU/ml;而可诱导慢病毒系统包装病毒的滴度为106～7TU/ml。3.两套慢病毒系统分别感染GEF,在不同饲养层条件下进行诱导培养,结果显示,只有在MEF作为饲养层的条件下诱导得到疑似iPS克隆,且只有可诱导慢病毒组获得可以增殖的疑似山羊iPS克隆。4.山羊iPS细胞生物学特性检测：1)对得到的疑似山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶染色及Tra-1-60,Tra-1-81,REX-1和SSEA-1免疫荧光染色,染色结果均呈阳性。2)提取疑似山羊iPS细胞RNA,RT-PCR检测一些相关的ES细胞标记基因,发现其表达Rexl、CDH1、Dnmt3b、TDGF,内源性Sox2及Oct4。3)对多能基因Nanog启动子区甲基化状态进行分析,结果表明Nanog基因启动子在山羊iPS细胞中大多数处于低甲基化状态,而在GEF中绝大多数处于高甲基化状态。4)在体外可形成拟胚体(Embryoidbody,EB),EB能自分化为各个类型细胞且表达三胚层标志性基因Fibronectin(外胚层)、Enolase3(中胚层)、AFP(内胚层)。5)将5×106个山羊iPS细胞分别注射到4只NOD/SCID小鼠皮下和后腿肌肉内,在体内可形成向三个胚层分化的畸胎瘤。表明得到的山羊iPS细胞具有多能性。
【作者】彭静；
【导师】蒋思文；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】转录因子；饲养层；干细胞表面标记基因；免疫荧光染色；山羊耳尖成纤维细胞；诱导多能干细胞；

【参考文献】
[1]刘康.基于中国京剧身体表演的体感游戏空间构造研究[D].哈尔滨工业大学,设计学,2014,硕士.
[2]熊强.基于元胞传输模型的城市快速路网建模与仿真分析[D].长安大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[3]景艳军.金州新区审计信息化建设研究[D].大连理工大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[4]李一平.长春市通信分公司市场竞争策略研究[D].吉林大学,2005.
[5]朱煜.城市循环物流系统构建研究[D].北京交通大学,2011.
[6]刘加利.高速列车气动噪声的理论研究与数值模拟[D].西南交通大学,2009.
[7]张结.IEC61850的狭义应用和广义应用[J].电力系统自动化,2005,10:92-96.
[8]黄振华.Ni-B合金镀层对碳材料的催化石墨化研究[D].湖南大学,2010.
[9]周长东,侯平阳.环向预应力加固圆形混凝土筒仓的静力性能[J].哈尔滨工业大学学报,2014,06:93-99.
[10]曾凡平.遥感图像CABAC全硬件设计研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[11]尚晓丽.小麦及其近缘物种脂肪酸氧化酶和puroindoline b-2基因型鉴定和分子特征研究[D].河南农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[12]刘明波.中国巨灾风险融资机制设计研究[D].西南财经大学,保险学,2014,博士.
[13]刘勇红.国企改制中资产价值确定问题研究[D].湖南大学,会计学,2010,硕士.
[14]陆海霞.关于《侗寨春意》的创作报告[D].湖南师范大学,美术（专业学位）,2014,硕士.
[15]杨立业.内蒙古阿拉善北部二叠系地质特征与构造演化[D].中国地质大学（北京）,古生物学与地层学,2014,硕士.
[16]常橙.2BYP-4型覆膜播种机的设计与试验研究[D].内蒙古农业大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[17]王莉,周献中,沈捷.一种改进的粗K均值聚类算法[J].控制与决策,2012,11:1711-1714+1719.
[18]王帅.Ti_2AlC/Cu复合材料的制备表征及其摩擦磨损行为研究[D].哈尔滨工业大学,材料学,2014,硕士.
[19]杨冬.新生小鼠卵巢移植片培育MⅡ卵制备胚胎干细胞[D].福建医科大学,细胞生物学,2014,硕士.
[20]张灿红.商业特许经营信息披露制度研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[21]杨萍.苦竹的分类研究及黄酮类物质的提取检测[D].浙江工业大学,生物化工,2004,硕士.
[22]韩敬荣.百年中学语文课程标准（教学大纲）中语文知识的发展历程研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[23]范彬.自抗扰控制技术在轻型高压直流输电系统中的应用[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[24]温萍.科学发展观视阈下我国高等航海教育发展对策研究[D].大连海事大学,马克思主义理论,2012,硕士.
[25]李吉伟.上市公司高管薪酬法律规制研究[D].吉林财经大学,民商法学,2014,硕士.
[26]孔邦杰.基于GIS的区域旅游资源与环境评价研究[D].浙江大学,农业遥感与信息技术,2004,硕士.
[27]王欢.新媒体环境下公共危机中的舆论引导[D].吉林大学,新闻学,2014,硕士.
[28]马宝山.适用于SiC薄膜生长的RTCVD装置及工艺探索[D].西安理工大学,材料物理化学,2004,硕士.
[29]张瑞.多媒体道路交通标志系统设计研究[D].沈阳航空航天大学,设计艺术学,2013,硕士.
[30]夏志军,李萍萍,胡永光,张伟.数据挖掘技术在温室作物生长预测中的应用[J].江苏大学学报(自然科学版),2003,02:20-22+37.
[31]朱伟.山东省费县地质灾害评价及其防治研究[D].中国地质大学（北京）,水利工程,2013,硕士.
[32]侯典立.开关式驱动无线功率传输系统若干问题的研究[D].山东大学,电力电子与电力传动,2014,博士.
[33]徐臻.功能对等视角下《荆棘鸟》两个中译本的对比分析[D].天津理工大学,英语语言文学,2013,硕士.
[34]石松,朱泉锋,唐丽玉.四叉树高效Delaunay三角网生成算法[J].计算机工程,2005,18:87-89.
[35]夏立.压力容器及管道RBI技术解读及改进方法的研究[D].浙江工业大学,2008.
[36]谢丹.新场气田须四气藏高产富集带预测[D].成都理工大学,地球探测与信息技术,2013,硕士.
[37]司静静.基于iTRAQ定量技术的泽漆乳汁的蛋白质组学研究[D].西北大学,植物学,2013,硕士.
[38]余金山.关于知识管理[J].计算机应用与软件,2005,09:37-38+135.
[39]宋运亭.健美操“俱乐部式”教学法在高校健美操教学中的运用研究[D].首都体育学院,体育教学,2013,硕士.
[40]童慧.中英高校文化产业人才培养的比较研究[D].湖南师范大学,高等教育学,2014,硕士.
[41]徐乐园.建构主义学习理论在职高英语口语教学中的应用[D].信阳师范学院,学科教学,2014,硕士.
[42]孙杨.论受贿罪的疑难问题[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[43]李友慧.苯乙酮和硝基烯烃纳米乳液的生物转化研究[D].北京化工大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[44]张守超.激活的Rap1和H-Ras对E-Cadherin介导的细胞间粘附连接的调节[D].哈尔滨工业大学,生物学,2013,硕士.
[45]王佩洲.目标:争创世界一流企业[J].企业活力.1992(01)
[46]沈义力.浙江省嘉兴县域经济发展战略研究[D].江西财经大学,政治经济学,2013,硕士.
[47]陈晓莹.湖南省高考英语测试对高中英语教学的反拨作用实证研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[48]汪廷彩.南瓜黄色素中叶黄素的纯化及特性研究[D].浙江大学,食品科学,2004,硕士.
[49]宋国栋.黄东海沉积物中磷的形态及其影响因素研究[D].中国海洋大学,海洋化学,2014,博士.
[50]王予希.对讲机的视频回传与录播系统的设计实现[D].北京交通大学,电子与通信工程,2013,硕士.