牛疱疹病毒5型编码的miR-10对其靶基因Us3的调控作用

【摘要】牛疱疹病毒5型(Bovineherpesvirus5,BoHV-5)属于α疱疹病毒亚科,具有嗜神经性和潜伏感染的特征。BoHV-5能进入中枢神经系统(CNS),引起犊牛的致死性脑膜脑炎,给养牛业造成很大的损失。本实验室曾经报道在BoHV-5中存在11个IniRNA的编码基因,能够编码16条成熟的miRNA.这些niRNA能够在上皮细胞中大量表达,其中miR-10是表达量最大的,该IniRNA的前体pre-miR-10的5p端和3p端都能产生一个成熟的miRNA,但其生物学功能还不是很清楚.本实验通过生物信息学预测找出了可能受到miR-10调控的靶基因,然后通过双荧光素酶报告系统筛选出能够与miR-10相互作用的靶基因。然后再在转录水平和翻译水平进一步验证(?)iR-10-5p对其靶基因的调控作用。主要工作包括：1.miR-10靶基因的预测及验证首先经过生物信息学预测软件(miRanda)分析,得到多个潜在受到miR-10调控的靶基因,经分析比较挑出UL23、BICP22、UL28、UL37、UL39和Us3。继而用PCR克隆上上述基因的3’UTR,连接到报告质粒psiCHECK-2上,用双荧光素酶报告系统进行验证。结果表明,UL39和Us3是miR-10的靶基因,其中miR-10-5p能够作用于Us3,miR-10-3p能够作用于UL39的。对miR-10-5p的种子序列进行突变,突变体则不能上调靶基因的表达。2.miR-10-5p对靶基因Us3的调控在上述工作的基础上,我们选择在病毒与宿主的相互作用中发挥重要作用的Us3开展进一步研究,通过real-timePCR和western-blot分别验证miR-10-5p对Us3的调控作用,结果表明]miR-10-5p对Us3的调控主要发生在蛋白质的翻译阶段,能够在上调Us3蛋白的表达。3.过量表达miR-10-5p对病毒增殖的影响为了进一步验证miR-10-5p作用于Us3是否对病毒具有作用,我们将miR-10-5p转染MDBK细胞,4h后以5MOI接种BoHV-5,在不同时间点收毒,测定病毒滴度。结果表明：过表达miR-10-5p后病毒的滴度变化不大,说明miR-10-5p的过量表达对病毒在上皮细胞中的复制与增殖没有影响。4.过量表达niR-10-5p后病毒对上皮细胞凋亡的影响由于Us3在病毒感染细胞诱导凋亡的过程中有重要作用,我们将miR-10-5p转染MDBK细胞,同时接种BoHV-5野毒,收集样品,提取细胞总蛋白,检测凋亡蛋白caspase-3的表达量。结果显示过量表达miR-10-5p后,能够上调感染细胞中caspase-3的表达量。表明miR-10-5p能够促进病毒感染诱导的上皮细胞凋亡进一步通过流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果表明过表达miR-10-5p的后细胞凋亡的数量增多,表明miR-10-5p的过表达确实具有促进病毒诱导的细胞凋亡,与检测凋亡蛋白caspase-3的结果相符。5.过量表达miR-10-5p后病毒对神经细胞凋亡的影响由于BoHV-5具有嗜神经性,我们进一步将miR-10-5p转染N2a细胞,同时接种BoHV-5野毒,在36h时收集样品,提取细胞总蛋白,检测凋亡蛋白caspase-3的表达量。实验结果显示过量表达miR-10-5p后,caspase-3表达量增加,表明miR-10-5p能够促进BoHV-5感染神经细胞的凋亡。经流式细胞仪检测,显示过表达miR-10-5p后的细胞凋亡的数量增多,表明miR-10-5p的过量表达确实具有促进病毒诱导的神经细胞凋亡的功能。综上所述,本研究通过双荧光素酶实验、Real-timePCR、western-blot、病毒增殖及细胞凋亡检测,系统的验证了BoHV-5编码的miR-10与其靶基因Us3的作用,为进一步揭示BoHV-5神经致病性以及为BoHV-1与BoHV-5的致病性差异提供重要的材料,同时为研制更好的疫苗和药物提供了参考。
【作者】周清；
【导师】刘正飞；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】牛疱疹病毒5型；miRNA；Us3；凋亡；增殖；

【参考文献】
[1]高智芳.纳米填料和高导热高分子复合材料的制备及其性能研究[D].天津大学,2013.
[2]李明珍.石墨烯领域发展态势及对策建议[J].科技与经济,2014,01:101-105.
[3]冯艺.我国旅游行业广告移动新媒体的分众传播研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[4]庞佳涵.电脑自动绕线机的研究与开发[D].大连理工大学,车辆工程,2004,硕士.
[5]李硕.气候变化对西北干旱区农业灌溉需水的影响研究[D].河北师范大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[6]应书光.LRC-201醋酸蒸发器液位自校正调节器[J].自动化学报,1980,02:85-93.
[7]商建峰.Ti-6Al-4V合金表面激光熔覆WC-12Co/NiCrAlY复合涂层组织性能研究[D].西北工业大学,材料学,2004,硕士.
[8]MorozovaElena（伊莲娜）.中俄合资企业跨文化管理研究[D].哈尔滨工业大学,企业管理,2014,硕士.
[9]樊双喜,钟其顶,李国辉,王健,熊正河,邹慧君,钱斌,周建弟,谢广发,李艳.近红外光谱法快速检测黄酒中氨基酸态氮的模型优化研究[J].酿酒科技.
[10]宋恭杰.冲床下死点定位精度检测与评价方法研究[D].宁波大学,机械工程,2013,硕士.
[11]焦克胜.丹参抗心血管疾病有效成分的虚拟筛选研究[D].郑州大学,物理化学,2013,硕士.
[12]李旻,唐茂林,刘俊勇,张蓓,张力,庞晓艳,朱清代.电网实时购电价格计算分析系统的研究与应用[J].电力系统自动化,2009,18:47-51.
[13]李蓓蓓.瓯海城建局办公管理信息系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[14]姚家平,张晓华,易浩特.湘钢第二炼钢厂转炉区基础自动化系统设计思路[J].冶金自动化,2000,05:1-6.
[15]麻常辉,薛禹胜,王小英,朱寰.基于静态和动态安全风险的输电规划(二)计及注入功率的不确定性[J].电力系统自动化,2006,14:10-13+61.
[16]李剑.乳腺癌TopoⅡα基因扩增与临床病理特征相关性研究及其检测的临床意义[D].山西医科大学,病理及病理生理学,2013,硕士.
[17]王忠,黄兆春,王林,查红,马金荣,张晓春.降低柴油机排放的匹配试验与燃烧过程分析[J].农业机械学报.2008(04)
[18]李洋洋.基于MIMO信号的检测技术研究[D].沈阳理工大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[19]师文英.一类中立型泛函微分方程的振动性[D].河北大学,基础数学,2002,硕士.
[20]文艳琼.对外汉语词汇教学研究综论[D].华中科技大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[21]杨国.宁夏引黄灌区水资源优化调配研究[D].西安理工大学,水利工程,2003,硕士.
[22]史其禄.中国饮料工业协会一九九三年工作计划[J].软饮料工业.1993(03)
[23]苏鸾声.南黄海5.3级地震短临前兆特征的研究[J].地震学刊.1994(01)
[24]孙旭春.抗倒酯等3种生长调节剂对多花黑麦草种子生产影响的研究[D].南京农业大学,草业科学,2011,硕士.
[25]沈珠江.关于修建漏水水库的建议[J].中国水利.2002(03)
[26]杨俊.计算机控制系统在轧钢生产线上的应用[J].冶金自动化,2011,05:26.
[27]李耀民.颈交感神经干离断对骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞活化的影响及镇痛作用[D].吉林大学,康复医学与理疗学,2014,硕士.
[28]赵海东,杨志杰,聂影.秦沈线点式应答器车次号确认系统的研究[J].铁道通信信号.2003(08)
[29]林琳.PTN、Survivin、VEGF在癌性胸腔积液中的表达及临床诊断意义的研究[D].辽宁医学院,肿瘤学,2012,硕士.
[30]张艳芳.中国剑术与日本剑道发展史比较研究[D].山东师范大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[31]韦铁.基于互联网的知识检索和管理的研究[D].西北工业大学,2004.
[32]赵玉良.某高校校园一卡通系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[33]尹克坚.基于用户感知的家校通网络运行系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[34]李轩.P2P流量控制系统的设计与实现[D].北京邮电大学,信息安全,2013,硕士.
[35]肖冰,王伟,邓飞其.一种多维关联规则算法的研究[J].重庆工商大学学报(自然科学版),2005,04:339-342+389.
[36]刘丽莉,方勇,王凯峰,梁霄,陈仁彪,李世岩,田素明,潘宏铭.CT引导射频消融治疗膈顶部肝癌的临床研究[J].肿瘤,2014,01:60-66.
[37]马振青.氧化石墨烯/氧化亚铜纳米复合材料的制备及其抑菌性研究[D].中国海洋大学,2014.
[38]胡鑫喆.基于球面并联机构的人形机器人肩关节仿生设计[D].燕山大学,机械电子工程,2014,硕士.
[39]武磊.单向环主干线管网供热系统的可靠性研究[D].哈尔滨工业大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2014,硕士.
[40]高文生.北京成寿寺经济适用型住房建设项目质量控制研究[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[41]朱莹.团队薪酬差距对个体绩效影响的实证研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[42]戴鹏.电力变压器智能冷却与经济运行综合控制研究[D].山东大学,电气工程（专业学位）,2013,硕士.
[43]卢志鹏.城市快速路入口匝道及辅路信号协调控制算法研究[D].北方工业大学,控制工程,2013,硕士.
[44]刘伟.论直辖市法律制度的完善[D].湖南师范大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[45]卢辉雄.非对称二苯乙烯衍生物的合成、光学性质及其抗菌活性研究[D].华南理工大学,制药工程,2014,硕士.
[46]罗娟.古代草部植物描写用语的发展[D].西南大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[47]曲广山,王沪生.关于车流调整适应市场经济环境的探讨[J].中国铁路.2001(06)
[48]马雪莉.商业银行操作风险管理的实务操作分析[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2013,硕士.
[49]DerouagMounira.阿尔及利亚国家高中英语毕业考试（BAC）与课程目标的关联一致性研究[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[50]钱澄浩.基于三维磁场测量的全并联AT牵引网故障定位方法研究[D].西南交通大学,轨道交通电气化与自动化,2013,硕士.