基于ACP和SSH技术的不同性别尼罗罗非鱼遗传差异分析

【摘要】罗非鱼是世界性的重要水产养殖对象之一,是联合国粮农组织向全世界推广的优良养殖鱼类,我国罗非鱼养殖产量居世界第一位,其中尼罗罗非鱼养殖最为广泛。尼罗罗非鱼体型、生长速度等性状方面在雌雄不同性别之间存在较大的差异,雄鱼的生长速度约比雌鱼快40-50%,而到性成熟时雄鱼个体明显大于雌鱼,严重影响商品鱼的整体出池,降低了尼罗罗非鱼产量和质量。另外由于繁殖快、成熟早,尼罗罗非鱼在养殖过程中极易出现繁殖过剩、密度过大、群体生长受阻、营养不良、个体过小等不利情况,从而直接影响罗非鱼的上市规格。开展性别控制技术研究,进行全雄罗非鱼的育种,具有重要的意义。对于不同性别尼罗罗非鱼遗传差异进行分析,将有助于提高全雄罗非鱼的育种效率利用退火控制引物技术(annealingcontrolprimer)对尼罗罗非鱼不同性别肌肉组织差异表达基因进行筛选,选择20对ACP随机引物分别对从同等条件下养殖的尼罗罗非鱼群体中的雌、雄鱼各5尾组成cDNA池进行差异显示PCR扩增,获得8个差异表达的ESTs。除3个为未知基因外,其余5个分别为60S核糖体蛋白(RL3)、肌型肌酸激酶M2-CK、小白蛋白p样蛋白、转录因子Sox4、转录变体3(LOC100691543)基因。半定量PCR分析各差异表达基因在5对尼罗罗非鱼雌雄个体肌肉组织中的表达发现,筛选到的8个基因在尼罗罗非鱼雌雄个体肌肉组织中存在表达差异。对各差异表达基因在尼罗罗非鱼雌雄鱼不同组织中的表达进行实时定量PCR分析发现,8个差异表达基因中ACP3-X、ACP15-X、60S核糖体蛋白(RL3)、肌型肌酸激酶M2-CK、小白蛋白p样蛋白和转录因子Sox4基因在尼罗罗非鱼雌鱼肌肉组织中的表达均高于雄鱼且差异极为显著(P<0.01)；转录变体3(LOC100691543)和ACP6-Y在尼罗罗非鱼雄鱼肌肉组织中的表达均高于雌鱼,且差异极为显著(P<0.01)。结果显示,通过ACP技术获得了8个可能参与雌雄鱼肌肉生长发育调控的ESTs,可以为进一步筛选雌雄鱼肌肉生长发育相关候选基因提供一些参考。利用SSH技术进行了尼罗罗非鱼雌鱼(XX)基因组差异基因的筛选,选取尼罗罗非鱼雌鱼(XX)、超雄鱼(YY)各10条尾鳍混合样组成的基因组DNA池,以雌鱼基因组DNA为试验方(Tester),以超雄鱼基因组DNA为驱动方(Driver),采用抑制性消减杂交技术,构建了尼罗罗非鱼雌鱼的基因组DNA消减杂交文库。在构建的文库中随机挑选1000个克隆,并进行扩大培养后进行测序,样本测序结果消除载体序列、接头序列和低于100bp的序列后获得了942条基因组DNA片段。依据网上数据库进行比对,共有125条序列注释到了结果,序列最长为1229bp,最短为157bp。125个已知基因包括肌钙蛋白1(calsequestrin1)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-likegrowthfactor1receptor-like,IGF-1R)、60S核糖体蛋白L36a(60SribosomalproteinL36a,partial)等基因。对尼罗罗非鱼雌鱼(XX)消减文库样本中所有ESTs进行GO分类发现,与分子功能分类(MolecularFunction)相关的ESTs中与分子绑定(binding)和催化活性(catalyticactivity)功能相关的ESTs最多。与细胞组成分类(CellularComponent)相关的ESTs主要集中在细胞组成(cellpart)和细胞(cell)功能上。在与生物过程功能分类(BiologicalProcess)相关的ESTs中,与细胞过程(cellularprocess)和代谢过程(metabolicprocess)相关的最多。KEGGpathway分析后,得知消减杂交文库中的基因参与了泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitinproteasomepathway)以及胰岛素信号通路(Insulinsignalingpathway)等代谢过程。这为进一步研究尼罗罗非鱼雌鱼(XX)特异性分子标记奠定了基础。尼罗罗非鱼超雄鱼(YY)基因组差异基因的筛实验中,以超雄鱼基因组DNA为试验方(Tester),以雌鱼基因组DNA为驱动方(Driver),采用抑制性消减杂交技术,构建了尼罗罗非鱼超雄鱼的基因组DNA消减杂交文库。在构建的文库中随机挑选1000个克隆,并进行扩大培养后进行测序,样本测序结果消除载体序列、接头序列和低于100bp的ESTs序列后获得了924条基因组DNA片段。测序结果在blastx网上数据库进行比对共有131条序列注释到了结果,最长为1270bp,最短为166bp。131个已知基因中包括肌球蛋白Ⅶa样蛋白(myosin-VIIa-like)、生长分化因子6-a(growthdifferentiationfactor6-a-like)、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)、驱动蛋白样蛋白KIF15-A(kinesin-likeproteinKIF15-A-like)、等基因。对尼罗罗非鱼超雄鱼消减文库样本中所有ESTs进行GO分类发现,与分子功能分类相关的ESTs中与分子绑定和催化活性功能相关的ESTs最多；与细胞组成分类相关的ESTs中与细胞组成和细胞功能相关的ESTs数目最多；与生物过程功能分类相关的ESTs中,与细胞过程和代谢过程相关的ESTs最多。KEGGpathway分析后,得知消减杂交文库中的基因参与了ABC转运体通路(ABCtransporters)、TGF-beta信号通路(TGF-betasignalingpathway)、钙离子信号通道(Calciumsignalingpathway)等代谢过程。为进一步获得YY型尼罗罗非鱼超雄鱼特异性标记基因奠定了基础。
【作者】吴奎；
【导师】邹桂伟；
【作者基本信息】华中农业大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】尼罗罗非鱼；不同性别；cDNA；基因组DNA；遗传差异；ACP；SSH；

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