小菜蛾肠道共生菌多态性及与Bt协同作用研究

【摘要】苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)作为大规模应用于田间害虫防治的生物农药,其杀虫机制的研究从70年代提出已经持续了几十年,研究者们从细胞水平以及分子水平等角度阐明了Bt的杀虫机理。近年来,一些研究者提出昆虫肠道微生物可以减少病原菌的增值或降低病原菌引起的寄主死亡率。昆虫肠道微生物的存在对苏云金芽胞杆菌引起的死亡也具有一定的影响。本研究以鳞翅目昆虫小菜蛾为供试昆虫,初步探讨在苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白处理的小菜蛾肠道微生物和正常健康饲养的小菜蛾肠道微生物群落组成以及群落多样性,分离了小菜蛾肠道可培养微生物,探讨了部分可培养的差异肠道共生菌与Bt杀虫活性之间的关系,为研究Bt杀虫机制提供一定的依据,并且为提高Bt杀虫毒力提供新的思路,研究结果如下：1.采用PCR-DGGE技术阐明未用Bt蛋白处理的小菜蛾肠道共生菌和用Bt蛋白处理之后小菜蛾肠道共生菌群落结构的变化。为了进一步明确肠道微生物种类的变化,构建了正常小菜蛾肠道共生菌和用Cry1Ac毒蛋白处理后的肠道共生菌的16SrDNA基因文库,比较两个文库肠道微生物的群落多样性发现：小菜蛾肠道微生物种类丰富,主要分布于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)。Y-变形菌纲和厚壁菌门为绝对的优势种群,约占两个文库总克隆子数的94.24%。而γ-变形菌纲的三个目中以肠杆菌目(Enterobacteriales)的种类最为多样,主要以肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)及柠檬氏杆菌属(Citrobacter)为主。对小菜蛾肠道微生物的两个文库的多样性指数、群落结构和系统发育树等分析后发现,两个16SrDNA基因文库的群落组成间差异显著。其中沙雷氏菌属、泛菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属和果胶杆菌属等细菌克隆子数量在用Bt毒蛋白处理之后较处理前有所增加；而克雷伯氏菌属和肉杆菌属的细菌相比处理前则有明显的减少；短杆菌属和黄杆菌属在药剂处理后的文库中只检测到3个克隆子。2.从健康小菜蛾幼虫肠道内分离纯化得到80株可培养细菌,提取细菌16SrDNA片段分析其基因序列,结合菌落形态以及菌株生理生化特性,鉴定为11株代表菌株,名称分别为：少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonaspaucimobilis、产吲哚金黄杆菌Chryseobacteriumindologenes、嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、浅黄假单胞菌Pseudomonasluteola、生癌肠杆菌Enterobactercancerogenus、普城沙雷菌Serratiaplymuthica、泛菌属Pantoeaspp、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae、阴沟肠杆菌Enterobactercloacea、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii、产气肠杆菌Enterobacteraerogenes。3.通过添加不同浓度的可培养差异菌(包括少动鞘氨醇单胞菌、产吲哚金黄杆菌、普城沙雷菌、泛菌属、嗜麦芽寡养单胞菌和生癌肠杆菌)到苏云金芽胞杆菌中,处理小菜蛾72小时后,检查小菜蛾的死亡率的情况来初步探讨这五种可培养肠道微生物在Bt发挥其生物活性的过程中起到的作用,发现普城沙雷菌和泛菌属细菌在Bt发挥其杀虫活性的过程中对小菜蛾起到了一定的保护作用,随着菌浓度的增大,对小菜蛾幼虫的致死率逐渐下降。对添加的非病原菌对昆虫的保护作用还有待进一步的研究。
【作者】戴楠晶；
【导师】李建洪；游红；
【作者基本信息】华中农业大学，农药学，2014，硕士
【关键词】苏云金芽胞杆菌；小菜蛾；肠道共生菌；杀虫活性；Bt；

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