华中地区猪源与牛源肠出血性大肠杆菌分离鉴定及生物学特性研究

【摘要】肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)是产志贺毒素大肠杆菌(Shiga-toxinproducingEscherichiacoli,STEC)的一类亚群,1982年被证实是一种重要的人畜共患病原菌,可以引起人不同程度腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagiccolitis,HC),溶血性尿毒综合症(Haemolyticuraemicsyndrome,HUS)等,严重的可导致死亡。其代表血清型为0157：H7,其它非0157EHEC血清型主要包括026、0111、O103、O121、045、O145、O104、O91等。本研究通过PCR方法结合头孢克肟-亚碲酸钾山梨醇麦康凯琼脂(Cefixime-potassiumtelluriteSorbitolMacConkey,CT-SMAC)平板分离法对采集的样本进行EHEC的分离与鉴定,并对分离菌株进行相关生物学特性研究,分析分离菌株之间的进化关系,以及与国际上流行的EHEC之间的亲缘关系。具体研究内容如下：1.肠出血性大肠杆菌的分离与鉴定运用PCR方法检测样本中EHEC的两个主要毒力基因stx1/stx2,结合CT-SMAC平板分离法对2011-2013年华中地区1477份样本(猪肠道内容物432份,猪粪便480份,牛粪便397份,牛奶99份,奶牛场环境中的水样69份)进行EHEC的分离,并通过革兰氏染色、生化鉴定、血清型鉴定、16SrRNA基因鉴定等方法对分离菌株进行鉴定。共分离到EHEC93株,占分离样本总数的6.30%(93/1477),其中猪源EHEC53株,占猪源分离样本总数的5.80%(53/912),牛源EHEC40株,占牛源分离样本总数的7.1%(40/565)。93株EHEC涵盖了28种血清型,以0157、O26、O91、O100、097、092为主要血清型。2.肠出血性大肠杆菌生物学特性研究对93株EHEC的溶血特性、致Vero细胞毒性、药物敏感性分析研究表明,8株猪源EHEC,5株牛源EHEC对5%脱纤维绵羊血红细胞有溶血现象。91株携带有stx1和/或stx2基因的EHEC都能使Vero细胞产生病变,其余2株EHEC没有携带stx1/stx2基因不能使Vero细胞产生病变。40株牛源EHEC对诺氟沙星的敏感率最高,达到97.5%。对阿莫西林、氨苄西林、先锋霉素Ⅳ、先锋霉素Ⅵ、卡那霉素、头孢噻肟的敏感率都在20%以内,基本不敏感。53株猪源EHEC对氧氟沙星的敏感率最高,达到88.7%,对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异恶唑、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、复方新诺明、卡那霉素、红霉素这10种药物完全耐药。EHEC分离株对小鼠致病性研究表明,6株受试代表菌株和标准菌株EDL933(O157:H7)感染后,死亡率有一定差异,出现临床症状的小鼠各组织器官主要病变为小肠(尤其是十二指)积液,局部肠粘膜水肿、充血、出血；盲肠、结肠水肿；心脏、脾脏无明显病理变化,肝脏、肾脏均有肿大出血；肺膨大。小鼠各组织器官活菌浓度可达到108CFU/g左右,以盲肠、结肠活菌浓度最高,其它脏器带菌量相对较少。3.肠出血性大肠杆菌多位点序列分型及遗传进化分析根据大肠杆菌mlst.ucc.ie数据库提供的多位点序列分型(MultilocusSequenceTyping,MLST)方案,对93株分离菌株7个管家基因进行PCR扩增,将PCR扩增产物送上海生工进行双向测序,将测序结果在大肠杆菌mlst.ucc.ie数据库中比对,从而确定每株菌的序列型。利用MEGA5.0软件分别对分离菌株进行分子分型及遗传进化分析,93株EHEC共有13个序列型(Sequencetype,ST),其中ST297为优势序列型,比例为31.1%(29/93)。遗传进化分析表明,ST297型与国际上流行的EHEC具有较近的亲缘关系。
【作者】郭锐；
【导师】吴斌；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】肠出血性大肠杆菌；分离与鉴定；生物学特性研究；多位点序列分析；遗传进化分析；

【参考文献】
[1]刘婷.侵权责任中的因果关系及其认定[D].沈阳师范大学,法律,2013,硕士.
[2]汪洋.中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子膜蛋白抽提及组成分析[D].华东师范大学,动物学,2013,硕士.
[3]周建明.城市合理规模测定方法综论[J].现代城市研究.1997(06)
[4]张彦伟.基于RFID与3G无线通信的分布式门禁系统研究[D].浙江理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[5]李明,王智灵,杨晓宇,陈宗海.突变期电力负荷预测方法及其应用[J].电力系统自动化,2006,10:93-96.
[6]韦志国.主体间性视野中的文学价值观[D].河北师范大学,文艺学,2004,硕士.
[7]彭文忠.SH公司绩效管理体系优化研究[D].浙江工业大学,工商管理,2012,硕士.
[8]郝文哲.基于FPGA的盲音频水印研究[D].江苏科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[9]张艳清.毕业设计（论文）管理系统研究与设计[D].厦门大学,控制工程,2014,硕士.
[10]金福祥.离子液体催化合成三聚甲醛动力学研究[D].兰州大学,化学工程,2014,硕士.
[11]卞寅.王夫之经济法律思想研究[D].南京师范大学,法律史,2012,硕士.
[12]罗可,蔡碧野,卜胜贤,谢中科.数据挖掘及其发展研究[J].计算机工程与应用,2002,14:182-184+232.
[13]毛文婷,张淑锵.叶笃正与浙江大学的研究生教育[J].浙江大学学报(人文社会科学版),2014,02:187.
[14]王威.渤海南部渤中A油田储层三维地质建模与油藏数值模拟一体化研究[D].西南石油大学,2013.
[15]陶胜男.辽宁省硕士研究生职业发展教育与就业指导课程建设研究[D].沈阳师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[16]闫妍.电磁轨道炮系统性能优化设计[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[17]于飞.基于短螺旋钻具旋挖钻机硬岩钻进的动力学研究[D].长安大学,机械电子工程,2013,硕士.
[18]王欢.东北春大豆花荚脱落性状与SSR标记的关联分析[D].中国科学院研究生院（东北地理与农业生态研究所）,遗传学,2014,硕士.
[19]汪洋.天然药物刺五加提取物缓释微球的研制[D].兰州大学,药剂学,2012,硕士.
[20]张景琪.铸态AZ80镁合金冷变形研究[D].中北大学,材料工程,2014,硕士.
[21]庄炳亮.中国地区黑碳气溶胶及其气候效应研究[D].南京大学,大气物理学与大气环境,2011,博士.
[22]刘君强,王勋,孙晓莹.智能型数据挖掘工具的设计与实现[J].计算机工程与应用,2003,17:195-197.
[23]吴成强,边康玲,杨清.S-8树脂对苯并三氮唑的吸附性能研究[J].浙江工业大学学报,2014,04:426-430.
[24]王其宝.保留根面牙骨质对牙周组织再生影响的实验研究[D].山东大学,口腔临床医学,2012,硕士.
[25]马彩霞.贵德回族服饰的民俗文化研究[D].青海师范大学,民俗学,2012,硕士.
[26]周珊珊.山东女排在2010-2011年全国女排联赛各区域间发球效果分析及对策研究[D].山东体育学院,体育教学,2012,硕士.
[27]张伟.相同气候条件下不同洞穴沉积差异机理研究[D].南京师范大学,第四纪地质学,2012,硕士.
[28]黄源.T市供水管网浊度特性的研究及其风险评估的应用[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[29]兀威.体外抑制哮喘患者炎性细胞因子生成作用的研究[D].第四军医大学,内科学,2004,硕士.
[30]孙再吉.美国研究人员改善石墨烯单晶制造方法有望用于生产商用电子元件和集成电路[J].半导体信息,2011,03:9-10.
[31]郭娜.新型农村合作医疗政策演变下住院服务可及性及其公平性研究[D].山东大学,社会医学与卫生事业管理,2014,博士.
[32]王彦云.YL450运梁车液压散热控制系统设计研究与实践[D].燕山大学,流体传动及控制,2014,硕士.
[33]袁轶群.新疆汉族、维吾尔族经典型霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染和P16蛋白的相关性研究[D].石河子大学,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[34]周洋.任家庄煤矿11306综采工作面煤自燃规律研究[D].西安科技大学,安全技术及工程,2013,硕士.
[35]蒋成侠.中国大学生英语写作中高频动词Find的句型应用[D].西南交通大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[36]任伟.基于LVDS的图像数据测试装置设计和实现[D].中北大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[37]杨占萍.我国矿业企业环境绩效评价指标构建研究[D].中国地质大学（北京）,会计学,2014,硕士.
[38]刘晓娜.金融消费者保护对金融包容影响的研究[D].对外经济贸易大学,金融学,2014,博士.
[39]赵韩涛,毛宏燕.有应急车辆影响的多车道交通流元胞自动机模型[J].物理学报,2013,06:53-60.
[40]蔡志拓.室内空间光影形态研究[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[41]田源.小型ISV营销策略创新研究[D].广西大学,政治经济学,2004,硕士.
[42]张春霞.人民币汇率波动对我国贸易收支的影响[D].山东大学,国际贸易学,2012,硕士.
[43]SICA.石墨烯应用探索研讨会[J].集成电路应用,2013,10:25.
[44]郭林根.表面纳米化纯铁的力学性能和织构研究[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[45]梁冰,甘久斌.中兴BRAS——网络安全的屏障[J].世界电信.2004(09)
[46]姚建国,杨胜春,单茂华.面向未来互联电网的调度技术支持系统架构思考[J].电力系统自动化,2013,21:52-59.
[47]宋志强.Pt/γ-Al_2O_3在纤维素加氢转化制六元醇中的应用研究[D].天津大学,化学工艺,2013,硕士.
[48]胡长沙.现代化视野下中国农民身份转化进程研究[D].华东师范大学,政治学理论,2013,硕士.
[49]赵军,井元伟,张嗣瀛.对称非线性控制系统的串级解耦标准形[J].自动化学报,1997,02:96-100.
[50]高雅.多级分组交换网络中基于负载均衡的调度算法研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2014,博士.