猪STMN1基因在肌肉生长发育中功能的初步研究

【摘要】Stathmin蛋白是一种微管解聚蛋白,主要通过磷酸化程度来调节自身的活性从而改变微管系统的动力平衡,进而参与调节细胞的增殖分化。研究表明STMN1基因在快速增殖分化的细胞中表达量高,在正常的组织细胞中基本不表达,在猪胚胎发育前期的肌肉组织中表达量高。本实验通过生物信息学对猪STMN1基因进行分析预测；克隆不同猪种STMN1基因的启动子和3’UTR区域；构建真核表达载体pcDNA3.1-STMN1和合成干扰小分子siRNA-STMN1转染C2C12细胞来上调/下调STMN1基因在C2C12细胞中的表达、利用荧光定量PCR及Westernblot等试验方法来验证STMN1基因对C2C12细胞的增殖分化功能的影响。研究结果如下：1.利用生物信息学的方法对猪STMN1基因结构进行分析,预测得到猪STMN1基因近端启动子区域位于+817bp至+1066bp处,同时预测得到猪STMN1基因近端启动子区域具有MyoD、GATA-1、HSF2等转录因子结合位点和1个大小1000bp左右的CpG岛。对不同物种STMN1基因表达的蛋白序列比对,发现Stathmin蛋白具有高度保守性。2.扩增通城猪、梅山猪、屯昌猪、杜洛克猪、大白猪、长白猪的STMN1基因的启动子及3’UTR区域,将扩增产物测序后用DNAMAN软件比对序列。发现在不同猪种中STMN1基因启动子区域的序列一致性很高,在启动子上游319bp、853bp、993bp、1161bp、1593bp、1859bp、1942bp、2154bp、2400bp处分别有T/C、A/G、A/G、A/G、C/T、C/T、C/G、C/T、C/T转换突变,可以将这些突变确定为启动子的潜在SNPs,同时在3’UTR区域也检测到14处潜在SNPs。3.通过克隆猪STMN1基因的CDS后成功构建过表达STMN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-STMN1;成功设计并合成了干扰STMN1基因的干扰小片段siRNA-STMN1,分别转染C2C12细胞来上调/下调STMN1基因的表达量。4.运用荧光定量PCR的方法检测了上调/下调STMN1基因表达后对C2C12细胞中与肌肉发育相关基因MyoD、MyoG、Myf5、MyHC的相对表达量。结果显示上调STMN1基因表达后,C2C12细胞中与肌肉发育相关的基因表达量都上调；下调STMN1基因表达后,C2C12细胞中与肌肉发育相关的基因表达量都下调。利用统计学软件SPSS对基因表达量进行分析,发现STMN1基因表达量的变化对C2C12细胞中与肌肉发育相关基因表达量的影响差异不显著(P>0.05)。说明STMN1基因参与肌肉的分化,但是不是影响肌肉分化中的关键基因,需要进一步研究。5.应用罗氏ARCE仪器对上调/下调STMNl基因表达后的C2C12细胞数量实时检测,结果显示STMN1基因表达量的变化对C2C12细胞数目有明显影响。使用统计学软件SPSS对测得数据分析,发现STMN1对C2C12细胞的增殖效果差异极显著(P<0.01)；同时用Westernblot的方法检测细胞增殖标志基因Ki67的表达量,检测结果与罗氏ARCE检测的结果一致。可以推测STMN1基因在细胞的增殖中起着重要作用。
【作者】宋志鹏；
【导师】雷明刚；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】猪；STMN1；荧光定量PCR；C2C12细胞；

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