小鼠卵泡发育过程中miRNA-351、miRNA-871的表达规律及其对卵泡颗粒细胞功能的调控研究

【摘要】MicroRNAs是长约19-25nts的小分子非编码RNA,在转录后水平调控基因表达,参与多种不同的生物学过程。为探讨microRNAs在小鼠卵泡发育过程中的表达、作用及调控机制,实验前期利用microRNAs深度测序技术构建了代表卵泡不同发育阶段的不同天数小鼠卵巢microRNAs表达谱。本课题以小鼠为实验动物,筛选在小鼠卵泡发育过程中差异表达或持续高表达的microRNAs(mir-871和mir-351),并利用Real-timePCR验证microRNAs深度测序结果。探究所筛选microRNAs在小鼠卵泡不同发育阶段及对应颗粒细胞中的表达规律,通过颗粒细胞和腔前卵泡体外培养模型,探究microRNAs对颗粒细胞增殖、凋亡及卵泡发育的影响。同时利用生物信息学结合实验验证的方法对microRNA靶基因进行预测和分析,以此进一步探索microRNAs对卵泡发育和颗粒细胞的作用和调控机制。主要研究结果如下：1.Real-timePCR检测mir-351和mir-871在不同阶段卵泡中的表达水平。结果显示：mir-351在小的腔前卵泡(90-120μm)表达最高,随卵泡发育的进行,其在次级卵泡(大的腔前卵泡)(150-250μm)中的表达显著下降(P<0.01)；21天小鼠注射PMSG48h后分离得到的较小有腔卵泡中(450-55μm)mir-351表达水平显著上调(P<0.01);hCG注射6h后分离得到的大的有腔卵泡(500-600μm)中表达水平显著降低(P<0.01)。对mir-871表达水平的检测结果发现,mir-871的表达量随小鼠卵泡直径的增加,表达量持续下降：即在小的腔前卵泡(100-130μm)中表达量最高,此后一直下降,在排卵前卵泡(500-600μm)中表达最低。综上,mir-351、mir-871在卵泡发育各阶段的表达有一定的规律性且存在显著性差异表达(P<0.05),与microRNAs深度测序的结果是一致的。此外,本实验也检测了与mir-351、mir-871在小鼠卵巢中具有相同表达规律的mir-191、mir-470和mir-199a在上述不同直径卵泡中的表达,结果与microRNAs深度测序的结果也是一致的。2.microRNAs在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达水平检测。分离卵泡发育各阶段卵泡颗粒细胞后利用Real-timePCR技术检测mir-351、mir-871的表达水平。结果显示,这几种microRNAs在卵泡颗粒细胞中均有表达,其表达规律与卵泡中的表达规律基本一致。3.过表达或敲低mir-351对颗粒细胞凋亡、增殖的影响。结果发现,过表达mir-351可显著诱导颗粒细胞的凋亡(P<0.01),而敲低mir-351的表达,其凋亡水平被显著性抑制(P<0.01)。这一结果暗示mir-351参与颗粒细胞凋亡的调控；此外,研究发现mir-351对颗粒细胞增殖无显著影响,而mir-871对颗粒细胞凋亡和增殖水平均无显著性影响。4.mir-351靶基因预测和初步研究。利用microRNA靶基因预测软件TargetScanMouse,microRNA.org,miRWalk,miRNAEntry,miRDBabase对mir-351的靶基因进行了预测。结合前期mir-351调控颗粒细胞凋亡的实验结果,我们筛选了部分可能与调控凋亡有关的靶基因：IGF1R、EGF、Stat3、Mapk14、Bmf进行进一步的验证和分析。在培养的颗粒细胞中过表达mir-351后,IGFIR、EGF、Stat3、Mapk14的mRNA水平显著性降低(P<0.01),而Bmf无显著性变化。利用mir-351抑制物敲低颗粒细胞中mir-351表达后,IGF1R、EGF、Stat3、Mapk14、Bmf的表达显著性提高(P<0.01)。这些结果暗示我们选择的这些候选靶基因可能都直接或间接受到mir-351的调控。综合mir-351调控颗粒细胞凋亡的研究结果,初步选择IGF1R和EGF作为进一步靶基因验证研究。5.mir-351参与小鼠有腔卵泡的形成。向小鼠腔前卵泡转染mir-351模拟物和抑制物,通过体外培养,发现转染mir-351Mimics的卵泡成腔率为25.7%,而MimicsNC组为51.8%。同时转染Inhibitor组成腔率为57.6%,而转染InhibitorNC组卵泡成腔率为45.5%。由此我们发现在小鼠腔前卵泡体外发育过程中,mir-351Mimics可降低有腔卵泡的形成率,而mir-351Inhibitor可提高其成腔率。这一结果暗示mir-351可以降低腔前卵泡的成腔率,这可能是通过影响颗粒细胞凋亡来发挥的。总之,本实验以不同日龄小鼠卵巢和超排激素处理后卵巢中microRNAs深度测序的结果为基础,筛选出mir-351和mir-871等几种具有特定表达规律的microRNAs,利用Real-timePCR进一步检测了其在不同发育阶段卵泡及对应颗粒细胞中的表达规律,利用microRNAs模拟物和抑制物研究了这几种microRNAs对颗粒细胞凋亡和增殖的影响,发现mir-351参与调控颗粒细胞凋亡过程,并初步筛选、验证了部分靶基因。这些结果将为深入理解卵泡发育过程和卵泡闭锁的调控机制奠定理论基础。
【作者】杜玉爱；
【导师】霍立军；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】mir-351；mir-871；卵泡发育；颗粒细胞凋亡；增殖；

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