布鲁氏菌核糖核酸酶RibonucleaseⅢ的酶活性研究

【摘要】布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性细菌,侵入人畜细胞后能够逃避宿主免疫系统并建立慢性感染,但其逃避免疫的机制还不完全清楚。最近研究发现,RibonucleaseⅢ(RNaseⅢ)、RNaseE和Hfq参与非编码RNA的调控,进而影响基因的表达。RNaseⅢ广泛地存在于细菌、真菌及真核生物中,是一类保守性很高的酶类。在体外,RNaseⅢ能够切割任何完全配对的具有双链结构的RNA,包括细菌自身RNA及病毒RNA。已有研究表明布鲁氏菌能够通过4型分泌系统将效应蛋白分泌到宿主细胞中,从而有利于布鲁氏菌在细胞中的运输。布鲁氏菌在侵入到宿主细胞后,是否会有RNaseⅢ通过4型分泌系统进入到宿主细胞中,在RNA水平影响宿主基因表达,以使布鲁氏菌能够更好的潜伏和增殖还未见报道。本课题克隆了羊种布鲁氏菌Brucellamelitensis编码RNaseⅢ的基因rncS,并对RNaseⅢ的重要氨基酸进行突变,获得rncS突变克隆ncS(E54A、D61A、E81A、E133A)。选择布鲁氏菌编码的具有双链结构的RNABM-pri-0015、BM-pre-0015以及miRBase收录的人源及伪狂犬病毒编码的成熟miRNAs的前体Hsa-let-7a-1、Hsa-mir-16-1、PRV-LLT1、PRV-LLT2作为RNaseⅢ的切割底物。首先,用凝胶阻滞实验(EMSA)检测RNA和RNaseⅢ的结合；其次,比较RNaseⅢ在切割这几种不同来源的具有双链结构的RNA生化活性的差异：包括金属离子(镁离子和锰离子)对切割活性的影响,盐离子(钠离子和钾离子)对切割活性的影响,pH对酶活性的影响；在此基础上,检测RNaseⅢ突变体的酶活,确定对RNaseⅢ酶活起到重要作用的氨基酸。本课题所得结果如下：1.凝胶阻滞实验表明RNaseⅢ不仅可以和布鲁氏菌编码的RNA结合,也可以和来自人源的及病毒的RNA结合；2.RNaseⅢ在含有锰离子或者镁离子时才能发挥切割活性,不同的底物所需的金属离子最适浓度不一样；3.RNaseⅢ在没有盐离子条件下具有切割活性;4.RNaseⅢ在碱性条件下的切割活性高,在酸性条件下酶活受到了抑制；5.RNaseIII的第133位氨基酸是酶活性所必须的。本课题通过RNaseⅢ的酶活实验表明布鲁氏菌RNaseⅢ的切割底物没有序列特异性,确定了RNaseⅢ的最佳酶活反应条件及必须氨基酸,为实验室研究布鲁氏菌非编码RNA提供了酶工具。
【作者】许先进；
【导师】傅振芳；刘正飞；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】布鲁氏菌；RNaseⅢ；切割活性；

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