RNA干扰抑制鸡成纤维细胞neurexophilin 1基因表达的研究

【摘要】RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)介导的一种特异性基因表达沉默现象,是一种古老但在进化上又高度保守的基因表达调节机制。近年来,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势已成为研究基因功能的新手段,在功能基因组学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛的应用。本研究利用RNAi技术,针对鸡贮精腺内差异表达的neurexophilin1基因mRNA序列设计了6对siRNA片段,与RNAi-ReadypSIREN-RetroQZsGreenplasmid载体连接,构建重组质粒,转染鸡成纤维细胞(chickenfibroblastcells,DF-1),通过实时荧光定量PCR检测转染后DF-1细胞中neurexophilin1基因的相对表达量,筛选干扰效果较好的重组质粒继续转染试验,转染24h后,吸取DF-1细胞培养液,测定干扰前后培养液内pH值、钙离子浓度、酸性磷酸酶浓度和碳酸酐酶浓度变化,研究结果如下：(1)neurexophilin1基因干扰载体的构建和鉴定以鸡(Gallusgallus)neurexophilin1基因mRNA序列为RNAi的靶序列,利用Ambion的在线设计软件设计并合成6对特异性干扰序列。与线性化pSIREN载体连接,构建neurexophilin1基因干扰载体。经HindⅢ酶切和测序鉴定,结果显示,特异性片段成功插入载体中,干扰载体构建成功。(2)DF-1细胞免疫荧光和Westren-blot鉴定用细胞免疫荧光和Western-blot检测1neurexophilin1在DF-1细胞中的表达情况。激光共聚焦显示neurexophilin1在DF-1细胞中呈分散表达,细胞质和细胞核中均有表达,且主要集中在细胞质。Western-blot结果表明,在DF-1细胞和Hela细胞,以及它们的细胞培养液中均含有neurexophilin1蛋白,且DF-1细胞培养液中有较高含量。(3)重组质粒干扰后neurexophilin1在鸡成纤维细胞内的表达通过实时荧光定量PCR检测重组质粒转染后DF-1细胞中neurexophilin1基因的相对表达量,对照组、空载体干扰组、psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3和psiRNA6干扰组基因的相对表达量分别为1.0003、1.1233、0.5801、0.3214、0.7903、0.3476,psiRNAl、psiRNA2、psiRNA3和psiRNA6干扰组,均成功抑制了靶细胞中目的基因neurexophilin1的表达,显著下调了其表达量(p<0.05)。重组质粒psiRNAl、psiRNA2、psiRNA3和psiRNA6对目的基因的抑制率分别达到42%、68%、21%和65%。(4)neurexophilin1基因干扰对DF-1细胞培养液环境的影响挑选干扰效果较好的psiRNA2和psiRNA6继续转染DF-1细胞,设定未转染处理组为对照。吸取转染24h后细胞培养液,检测其中pH值、钙离子、酸性磷酸酶和碳酸酐酶变化,每组20次重复。结果表明,neurexophilin1基因被抑制表达后：①原培养液组、空载体组、psiRNA2和psiRNA6干扰组pH值分别为6.74、7.04、7.03、6.77,psiRNA6干扰组较空载体组pH值显著降低(p<0.05),psiRNA2干扰组差异不显著(p>>0.05)；②原培养液组、空载体组、psiRNA2和psiRNA6干扰组钙离子浓度分别为1.88667mmol/L、1.90400mmol/L、1.89071mmol/L.1.89000mmol/L,psiRNA2、psiRNA6较空载体组钙离子浓度均降低,但差异不显著(p>>0.05)；③原培养液组、空载体组、psiRNA2和psiRNA6干扰组酸性磷酸酶浓度分别为0.1149mM、0.0723mM、0.0340mM、0.0291mM,psiRNA2和psiRNA6干扰组较空载体组酸性磷酸酶浓度显著降低(p<0.05)；④原培养液组、空载体组、psiRNA2和psiRNA6干扰组碳酸酐酶浓度分别为12.9525U/L、12.9600U/L、13.2427U/L.12.9025U/L,psiRNA2和psiRNA6组与空载体组相比,差异不显著(p>0.05)。以上研究结果表明,neurexophilin1基因被干扰后,对DF-1细胞培养液环境产生了影响,为neurexophilin1调控鸡贮精腺微环境和更进一步探索禽类贮精腺贮精机理奠定了理论基础。
【作者】孙冬梅；
【导师】姜勋平；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】neurexophilin1；RNA干扰；贮精腺；微环境；DF-1细胞；

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