PRRSV WUH3株非编码区诱导IFN-β的能力及其机制研究

【摘要】猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS),俗称蓝耳病,该病自发现以来给世界养猪业造成了巨大的经济损失,而2006年在我国出现的高致病性蓝耳病更是给我国养猪业造成了几乎是毁灭性的打击。猪繁殖与呼吸综合征的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV),PRRSV的基因组为一条具有甲基化帽和poly(A)尾的单股正链RNA,5’末端为帽子结构和5’非编码区(5’Untranslatedregion,5’UTR),3’末端为3’非编码区(3’UTR)和poly(A)尾,中间包含10个开放阅读框(Openreadingframe,ORF)。已证实动脉炎病毒的基因组UTR在病毒基因组RNA复制、亚基因组nRNA转录和蛋白翻译过程中发挥着关键的作用,但其在诱导干扰素(Interferon,IFN)中的作用尚不清楚。为了探究PRRSVUTR在诱导干扰素中的作用,我们开展了以下研究工作：1.PRRSVWUH3株非编码区在Marc-145细胞中诱导IFN-β能力的研究为了研究PRRSVWUH3UTR在Marc-145细胞中是否可以诱导IFN-p,体外转录并纯化3’UTR和5’UTR。将IFN-p启动子荧光素酶报告质粒pIFN-β-Luc和内参质粒pRL-TK共转染Marc-145细胞,24h后转染UTR,于转染后不同时间点收集细胞样品,利用荧光素酶检测系统分析IFN-β启动子活性,结果转染UTR细胞的荧光素酶活性显著高于阴性对照细胞(转染tRNA),并且转染5’UTR细胞的荧光素酶活性显著高于阳性对照细胞(转染poly(I:C)),说明PRRSVWUH3株UTR可以激活IFN-β启动子,而且5’UTR具有更强的激活能力。进一步将PRRSVWUH3株3’UTR和5’UTR分别转染Marc-145细胞,并于转染后不同时间点收集细胞和细胞上清,利用荧光定量RT-PCR检测IFN-βmRNA表达水平,ELISA检测IFN-β蛋白表达水平。结果显示3’UTR和5’UTR在不同时间点均能显著增强IFN-βmRNA和蛋白的表达。2.UTR的5’-ppp对UTR诱导IFN-β能力影响的研究天然状态下,5’UTR的5’端被磷酸化,3’UTR的5’端没有被磷酸化,而我们利用体外转录方法得到的UTR的5’端均被磷酸化。为了模拟真实状态,了解5’-ppp在UTR诱导IFN-β过程中的作用,用牛小肠碱性磷酸酶(Calfintestinalalkalinephosphatase,CIP)对体外转录获得的UTR进行去磷酸化处理,转染细胞后利用ELISA试剂盒检测IFN-β的表达情况,结果证实去磷酸化的UTR仍然可以诱导IFN-β的产生,但其诱导能力显著下降,说明5’-ppp能增强UTR诱导IFN-β的能力。由此推断,PRRSV基因组5’端的磷酸化可能有助于细胞识别病毒。3.UTR的二级结构对UTR诱导IFN-β能力影响的研究众所周知,病毒的基因组并非完全呈线性化状态,其碱基间可相互配对形成二级结构。为了研究UTR的二级结构在其诱导IFN-β的过程中的作用,分别用变性和复性缓冲液处理体外转录获得的UTR,使其处于变性或复性状态,转染细胞后,利用荧光素酶检测系统分析IFN-β启动子活性,结果转染变性UTR的细胞荧光素酶活性显著下降,且5’UTR的激活能力下降较3’UTR下降显著。同时RNA二级结构的预测表明5’UTR具有更复杂的二级结构,实验结果提示UTR的二级结构可以增强其对IFN-β的诱导能力。4.不同UTR缺失突变体诱导IFN-β能力差异的研究为了研究UTR中是否存在可以特异性诱导IFN-β的区域,根据二级结构的预测结果制备了一系列UTR的缺失突变体,转染细胞,利用荧光素酶检测系统分析IFN-β启动子活性,结果发现转染不同UTR缺失突变体的细胞荧光素酶活性存在显著差异,说明UTR中可能存在可以被模式识别受体特异性识别的区域。5.利用siRNA技术初步探究UTR激活IFN-β的信号通路的研究RNA可以被TLR3(Toll-likereceptors3,TLR3)识别,招募TRIF(TIRdomain-containingadaptorinducingIFN-β),或者被RIG-(Retinoicacid-induciblegeneI)/MDA5(Melanomadifferentiation-associatedgene-5)识别募集IPS-1(IFN-βpromoterstimulator1)和STING(Stimulatorofinterferongenes),然后分别活化其下游分子,最终激活IRF3(Interferonregulationfactor3)及NF-kB(Nuclearfactor-kappaB),调控]IFN-β的产生。为了探究UTR诱导IFN-β产生的机制,将TLR3、RIG-I、MDA5及其接头分子IPS-1、STING、TRIF的干扰分子分别转染Marc-145细胞,24h后转染5’UTR,通过荧光定量RT-PCR检测IFN-βmRNA的表达,结果表明这些基因的沉默均能降低5’UTR诱导IFN-βmRNA的能力。说明5’UTR可以通过RIG-I/MDA5及TLR3途径诱导IFN-β的产生。
【作者】鲍鑫莹；
【导师】方六荣；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒；非编码区；天然免疫；IFN-β；信号通路；

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