百脉根LjZFP3基因在根瘤发育中的功能研究

【摘要】锌指蛋白型转录因子参与调控植物的生长发育,根据所含锌指结构的不同,可将植物C2H2型锌指蛋白分为四类：单锌指类、双锌指类、三个锌指类和四锌指类。已有的研究表明,单锌指类蛋白在植物器官发育中起着重要作用。本人所在研究室前期从豆科植物-百脉根中鉴定出一个参与根和根瘤发育相关的单锌指蛋白LjZFP3,并初步研究了该蛋白结构、表达特征和生理功能(李雪梅硕士论文)。本研究在此基础上,进一步开展了LjZFP3基因在根瘤形成过程中表达特性、LjZFP3蛋白亚细胞定位及突变体表型等方面的研究。主要研究结果如下：1.利用实时荧光定量PCR技术,检测了LjZFP3基因在百脉根接种根瘤菌后2h、6h、12h、1d、2d、6d、8d在根及根瘤中的表达水平。结果表明：LjZFP3在接种和未接种根中均有表达,而在接种6d后表达量略微上升,直到8d上升到最高。在植株不同器官中呈组成型表达,而在根瘤中的表达量高于根和地上部分。同时,构建LjZFP3Pro::GUS转录融合载体进行组织化学表达分析。结果表明：LjZFP3主要在根的韧皮部、根瘤原基和正在发育的根瘤表达,成熟和衰老的根瘤中则只在维管束中表达。2.构建了GFP与LjZFP3的融合表达载体,通过农杆菌转化烟草叶肉细胞瞬间表达,发现LjZFP3定位于细胞核中。进一步通过发根农杆菌毛根转化,将融合表达载体导入百脉根根中,在激光共聚焦显微镜下观察发现LjZFP3也定位于根毛和皮层细胞核中。3.为了鉴定LjZFP3基因在共生过程中的功能,利用毛根转化技术,进一步验证了LjZFP3过量表达和下调表达对百脉根植株根瘤数的影响。结果表明：LjZFP3过量表达植株结瘤数较对照组显著增多；而LjZFP3基因下调表达后,植株的结瘤能力受到影响,表现为侵入线降低,根瘤原基数量减少。这表明LjZFP3在根瘤的形成过程中具有重要功能。4.突变体表型分析：从百脉根反转座子LORE1插入突变体库中鉴定到两个突变体,分别命名为Ljzfp3-1(插入在760bp位置)和Lizfp3-2(插入在548bp位置)。通过鉴定,共获得3株纯合体：Ljzfp3-1得到1株、Ljzfp3-2得到2株。得到纯合突变体种子后,进行结瘤梯度实验,10d时,zfp3-1结瘤数无明显差异,但在21d统计时发现,结瘤数比对照明显减少,zfp3-2表型较明显,与对照比结瘤数显著减少,差异极显著,zfp3-2根长及地上部分也受到影响,这表明LjZFP3在根及根瘤的发育中起着重要作用。
【作者】李丽；
【导师】张忠明；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】百脉根；锌指蛋白；根瘤发育；突变体；

【参考文献】
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