莽山野柑特征香气相关候选基因克隆和功能鉴定

【摘要】莽山野柑(CitrusnobilisLauriro)是一种珍贵的野生柑橘种质资源,利用GC-MS分析莽山野柑果皮挥发性物质发现其特征香气为p-月桂烯(β-myrcene)和芳樟醇氧化物(linalooloxide),芳樟醇(linalool)也有积累。伴随着经济的快速发展,生活水平的日渐提高,消费者无论是对柑橘的需求量还是品质的要求都越来越高。GC-MS技术的应用使果实香气的研究越来越受到人们的关注,但香气成分的形成、代谢及调控的相关酶以及香气形成与转化机制的研究较少。常规基因功能鉴定因时间长,受植物体复杂本底影响等因素的干扰,导致实验结果不理想。体外功能验证成为验证柑橘香气物质合成相关基因的功能的有效途径。本研究以从莽山野柑中克隆得到的月桂烯合酶(MYRS)和芳樟醇合酶(LIS)基因为研究对象,利用大肠杆菌诱导表达获得外源蛋白进行体外功能鉴定,探索莽山野柑果实中香气成分p-月桂烯(β-myrcene)和芳樟醇(linalool)高积累的分子机理,同时也为将来利用代谢组学、转录组学等手段研究柑橘萜类生物合成与调控的代谢网络提供参考和依据。获得主要结果如下：1.对MYRS和LIS两个基因的cDNA全长进行了克隆和序列分析。克隆获得一条MYRS基因和两条LIS基因(LIS-L及LIS-S)。通过对随机挑取的20个克隆测序表明,两个LIS基因在莽山野柑中出现的频率相似,两条LIS两条基因之间有37个碱基的差别,分别为一段长33bp的片段插入和两者之间的4个单核苷酸突变。分析MYRS和LIS基因发现其均含有单萜合酶保守结构域RRxgW和DDxxD。2.莽山野柑成熟果实黄皮层中MYRS的表达量分别是白皮层、囊衣和汁胞中的88.71倍、876.02倍和69.38倍。3.分别构建了LIS-L、LIS-S和MYRS的全长及切除转运肽的原核表达载体pET-CsLIS-L-fl,pET-CsLIS-L-tr;pET-CsLIS-S-fl,pET-CsLIS-S-tr及pET-CsMYRS-fl和pET-CsMYRS-tr,转化大肠杆菌,经IPTG诱导和WesternBlot验证,表明该体系成功获得LIS-L、LIS-S和MYRS的全长和切除转运肽的蛋白。4.分别纯化了带有His-tag融合头的目的基因全长蛋白和去信号肽蛋白,并构建蛋白体外验证体系。分别添加底物香叶基二磷酸(GPP)和法呢基焦磷酸(FPP)与蛋白进行反应,并利用GC-MS对反应获得的产物进行检测。发现在切除转运肽后,MYRS和LIS-S在切除转运肽后编码的蛋白可催化底物GPP合成产物,而LIS-L则没有该功能。5.克隆国庆1号温州蜜柑蜜柑(C.unshiuMarc)成熟果实果皮的LIS基因,并调取甜橙(C.sinensisOsbeck)基因组库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中LIS候选基因,与莽山野柑LIS基因比对,发现只在莽山野柑中存在两条LIS基因,在其他品种中均以LIS-L一种形态存在。通过本研究,初步探究了莽山野柑特殊香气物质形成可能的机理,体外验证了月桂烯合酶(MYRS)和两个芳樟醇合酶(LIS)候选基因可能的功能,为深入探求柑橘香气物质产生打下基础。
【作者】方柳；
【导师】徐娟；
【作者基本信息】华中农业大学，果树学，2014，硕士
【关键词】莽山野柑(Citrus.nobilis)；月桂烯合酶基因(CsMYRS)；芳樟醇合酶基因(CsLIS)；原核表达；体外验证；

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