不同地理源蜂胶酚类物质分析及其对变形链球菌抑制作用研究

【摘要】近年来由于蜂胶在医药学中的广泛应用而受到很高的关注,它具有抗氧化、抑菌、消炎、抗肿瘤等生物活性,而这些生物活性与其复杂的化学成分有密切关系,因此对其化学成分及生物活性的研究具有很高的科学价值。中国地域广大,跨越温带、亚热带、热带地区,各地蜂胶性状不同,而环境地理条件与蜂胶品质之间的关系近年来成为蜂胶研究的重点,因此本论文采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用法(Highperformanceliquidchromatography-ElectrosprayIonization-massspectrometry/massspectrometry,HPLC-ESI-MS/MS)分析中国蜂胶乙酸乙酯提取物(Ethylacetateextractionofpropolis,EaEP)中的酚类化合物,对蜂胶中含有的7种典型黄酮类化合物进行定量分析,并研究中国不同地理源EaEP对变形链球菌(Streptococcimutans,S.mutans)生长、产酸、粘附的影响,建立环境地理条件对蜂胶酚类化合物的影响及其与蜂胶抗龋齿活性的联系,通过扫描电镜与透射电镜对加入EaEP前后的S.mutans进行形态学观察,探索蜂胶酚类化合物对S.mutans的抑菌机理。主要研究内容和实验结果如下：1.蜂胶酚类化合物的提取与HPLC分析方法的建立：通过比较蜂胶乙酸乙酯、95%乙醇、70%乙醇提取物对S.mutans在玻璃管壁的粘附抑制率,发现EaEP对S.mutans在玻璃管壁上的粘附抑制率最高,高于95%和70%乙醇提取物,也高于对照物NaF,说明EaEP的抗龋齿活性优于其他两种溶剂提取物,因此采用乙酸乙酯作为本研究蜂胶活性成分的提取溶剂。在此基础上,建立了分离EaEP中酚类化合物的反相高效液相色谱-二极管阵列(Reversedphasehighperformanceliquidchromatography-Diodearraydetector,RP-HPLC-DAD)条件:流动相A为0.3%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,检测波长为280nm,使用ThermoHypersilGOLDC18(250mmx4.6mm,5.0μm)色谱柱在柱温30℃,流速1mL/min条件下,以梯度洗脱的方式分离蜂胶酚类化合物,所分离物质基本上可以达到基线分离。方法学考察精密度、稳定性、重复性的相对标准偏差都控制在5%内,10种黄酮对照品的检出限在0.7813-4.6875×104mg/mL之间,加标回收率范围在93.40%-103.69%,且相对标准偏差均小于2%,说明该RP-HPLC-DAD分析方法科学可靠。2.蜂胶酚类化合物的鉴定：采用RP-HPLC-ESI-MS/MS法对EaEP进行分离鉴定,通过分析EaEP经过HPLC分离的色谱峰的紫外(Ultraviolet,UV)光谱信息、对应母离子和二级质谱的碎片离子,并结合已知黄酮对照品共鉴定出26种酚类物质,包括7种酚酸,19种黄酮类化合物：其中,槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素、白杨黄酮、松属素和高良姜素是经过与对照品比较相对保留时间,UV光谱,MS的碎片离子等鉴定出的；而木犀草素、短叶松素、7-甲氧基白杨素、5-甲氧基高良姜素、5-甲氧基短叶松素-3-乙酸酯、5-甲氧基短叶松素、7-甲氧基槲皮素、樱花素、短叶松素-3-乙酸酯、短叶松素-3-丙酸酯、短叶松素-3-异丁酸酯、短叶松素-3-O-戊酸酯、3,4-二甲氧基肉桂酸、咖啡酸异戊二烯酯、咖啡酸、咖啡酸苄酯、咖啡酸苯乙酯、对香豆酸苄酯、咖啡酸肉桂酯是分析质谱的裂解途径,并结合前人研究结果从而鉴定出的酚类物质。本研究建立的HPLC-ESI-MS/MS分析方法准确可靠,可以达到对蜂胶酚类物质定性、定量分离鉴定的目的；比较了中国12个地理源(选自暖温带、中温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原温带)EaEP液相色谱图总峰面积和7种典型黄酮总含量,发现湖北宜昌(北亚热带)、山西太原(暖温带)、浙江杭州(北亚热带)3个地理源EaEP中7种典型黄酮总含量和总峰面积比其他地理源的要高。3.EaEP对S.mutans生长、产酸和粘附的影响：测定EaEP对S.mutans的最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)发现EaEP中7种黄酮总含量与MIC值成负相关,存在极显著(P=0.004<0.01)量效关系,EaEP液相色谱图中总峰面积与MIC值也成负相关,量效关系极显著(P=0.004<0.01),说明EaEP中7种典型黄酮含量越高,酚类物质含量越高,对S.mutans生长的抑制作用越强,该地理源蜂胶的抗龋齿活性越强。测定EaEP对S.mutans产酸的抑制效果,结果显示EaEP中7种黄酮总含量与ΔpH值成极显著(P=0.005<0.01)的正相关,EaEP液相色谱图总峰面积与ΔpH值具有极显著(P=0.006<0.01)的正相关效应,说明蜂胶7种典型黄酮含量越高,酚类物质含量越高,对S.mutans产酸的抑制作用越强,即该地理源蜂胶的抗龋齿活性越强。测定EaEP对S.mutans在玻璃管壁粘附抑制效果和半抑制浓度(IC50),结果显示EaEP对S.mutans粘附的抑制效果成非线性浓度效应关系,EaEP中7种黄酮总含量、总峰面积与IC50值均无相关性,说明EaEP中酚类物质含量以及7种黄酮总含量对S.mutans在玻璃管壁的粘附作用没有相关性。4.EaEP对S.mutans细胞形态和结构的影响：通过扫描电镜和透射电镜观察,发现加入EaEP后的S.mutans与加入EaEP之前对比,细菌细胞表面变得粗糙,有黏状物产生,形状变得不规则,细胞壁被破坏,细胞膜通透性发生变化,细胞质出现泄漏,同时部分细胞细胞壁附近出现亮白色圆弧状物质；加入EaEP后对S.mutans的分裂也产生巨大影响,分裂中的细胞横膜不清晰,两个子细胞大小不一,且在分裂过程中两个子细胞就出现细胞壁被破坏,细胞质泄漏现象,说明EaEP对S.mutans的菌体结构及细胞分裂产生破坏,也在一定程度上解释了蜂胶的抗龋齿活性。
【作者】王冰；
【导师】刘睿；
【作者基本信息】华中农业大学，农产品加工及贮藏工程，2014，硕士
【关键词】蜂胶；地理源；EaEP；黄酮；HPLC-ESI-MS/MS；S.mutans；

【参考文献】
[1]牛苏会.峰峰煤田小屯矿下组煤开采水文地质可行性研究[D].石家庄经济学院,地质工程,2012,硕士.
[2]卜令兵.光通信中EDFA增益平坦化研究及理论模拟[D].华东师范大学,光学,2003,硕士.
[3]王颖.全成本条件下商业地产项目投资决策评判模型研究[D].西安建筑科技大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[4]师帅田.孝道观念对成年子女支持父母的影响[D].华中科技大学,社会学,2013,硕士.
[5]谢丽欣.新型富勒烯受体光伏材料的合成及光伏性能研究[D].中国科学技术大学,材料学,2014,硕士.
[6]肖建国.电子商务环境下的银行信息化建设[J].湖北农村金融研究,2004,02:54-56.
[7]任泽宏.城市物流绿色化研究[D].吉林大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[8]楚尚威.金融行业真实型领导对离职倾向的影响研究：心理资本的中介作用[D].广东财经大学,企业管理,2014,硕士.
[9]李海云.广东省佛山市南海区流动人口计划生育网格化管理服务研究[D].吉林大学,社会医学与卫生事业管理,2014,硕士.
[10]左勇.选择性催化转化纤维素制备乙酰丙酸[D].中国科学技术大学,有机化学,2014,硕士.
[11]崔忠刚.新型透明导电电极的模板法构筑及其光电特性[D].河南大学,2012.
[12]冯昊.带压开采下底板渗流与应力耦合破坏突水机理研究[D].西安科技大学,矿业工程,2014,硕士.
[13]杨东.万箱集装箱船余热回收系统设计与性能分析[D].江苏科技大学,轮机工程,2013,硕士.
[14]李袁庆,刘志远,王成君.石墨烯材料的研究进展[J].生物技术世界,2013,03:154.
[15]陈伟,陈耿,朱文明,王昊.基于业务规则的错误数据清理方法[J].计算机工程与应用,2005,14:172-174.
[16]柳艳秋.农村土地流转政策下科技推广服务模式研究[D].湖南农业大学,农业科技组织与服务,2012,硕士.
[17]刘希清.安全防范与智能建筑(二)[J].中国安防产品信息.1999(04)
[18]邝海宝.面向印尼学习者的汉语多音字研究[D].沈阳师范大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[19]倪茂林.对“具有参数跟踪自适应观测器的故障检测与诊断系统”一文的商榷[J].自动化学报,1993,06:756-757.
[20]易晓东.失肌皮神经与屈肘重建后供受体肌肌肉型AChR亚型表达变化[D].遵义医学院,人体解剖学与组织胚胎学,2014,硕士.
[21]邢伟博.两种不同来源卵黏蛋白O-及N-糖链的电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析[D].西北大学,细胞生物学,2013,硕士.
[22]钱学双.类间散度特征选择法及其应用[J].自动化学报,1986,01:10-17.
[23]林健浩.基于SIP协议的音视频会话技术研究[D].广东工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[24]江沈红.孔子、孟子、荀子思想与思想政治教育初探[D].武汉理工大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[25]焦放健.钻井液油气分离膜的制备与应用研究[D].厦门大学,化学工程,2014,硕士.
[26]朱良军,金光泽,王晓春.典型阔叶红松林干扰历史重建及干扰形成机制[J].植物生态学报,2015,02:125-139.
[27]张秀萍.我国商业银行贷后管理研究[D].山西财经大学,金融学,2014,硕士.
[28]刘彦宇.基于计划行为理论对超速行车意向的研究[D].浙江理工大学,应用心理学,2013,硕士.
[29]夏火松.基于MKM的市场营销群体决策支持系统结构的研究[J].管理科学,2003,01:61-64.
[30]郭复胜,高伟.基于辅助信息的无人机图像批处理三维重建方法[J].自动化学报,2013,06:834-845.
[31]皋香.菠萝蜜主要风味成分及其在果汁加工中的变化研究[D].海南大学,农产品加工及贮藏工程,2014,硕士.
[32]刘光临,刘梅清,董益林,徐叶琴.大型双速全调节轴流泵的运行特性[J].农业机械学报.1993(03)
[33]吴宇轩.遗传模糊控制及其在优化控制中的应用研究[D].东北石油大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[34]刘远军.基于视频的高速公路车辆的自动检测与跟踪研究[D].湖南大学,计算机技术,2010,硕士.
[35]刘波,张岩,马明,李厚达.平台化合物5-乙氧甲基糠醛的最新研究进展[J].山东化工,2015,09:49-52.
[36]李静.甲醇柴油乳液制备及性能研究[D].中北大学,化学工程,2014,硕士.
[37]朱智新.国际刑事责任主体研究[D].河北经贸大学,国际法,2014,硕士.
[38]王玲.上市公司内部控制信息披露对权益资本成本影响的实证研究[D].西安科技大学,企业管理,2013,硕士.
[39]李海舰,陈小勇.企业无边界发展研究——基于案例的视角[J].中国工业经济,2011,06:89-98.
[40]陈明,周健明.企业文化、知识整合机制对企业间知识转移绩效的影响研究[J].科学学研究,2009,04:580-587.
[41]张天四.轨道翻转同宿环的共振分支[D].华东师范大学,应用数学,2004,硕士.
[42]王文涛.交通荷载下公路路基动力响应及软土下卧层累积变形研究[D].浙江大学,土木工程,2012,硕士.
[43]方美.舒芜文艺思想研究[D].安徽大学,文艺学,2013,硕士.
[44]邵吉光,王军.连续渗流模型理论下的证券价格过程[J].系统工程学报,2014,04:487-493.
[45]林瑞霞.城轨车辆制动能量回收效率理论及试验研究[D].上海工程技术大学,车辆工程,2013,硕士.
[46]乔凯.中国人群中SBMA电生理、基因及其相关性研究[D].复旦大学,神经病学,2010,博士.
[47]张川.磷酸铁锂/石墨烯复合正极材料研究[D].电子科技大学,2013.
[48]黄志坚.网上宠物商店系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[49]段思思.清淡隽雅，灵秀散远[D].曲阜师范大学,美术学,2013,硕士.
[50]张博.基于排队重置的中小城市区域交通信号控制方法研究与应用[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.