牛腐蹄病坏死梭杆菌lktA、hly和43K OMP基因的截短表达与反应原性鉴定

【摘要】本试验依据多表位疫苗的设计思路，以牛坏死梭杆菌的主要毒力因子白细胞毒素（lktA）、溶血素（hly）及43K外膜蛋白为研究对象筛选出白细胞毒素、溶血素及43K外膜蛋白毒力因子中的抗原表位区，为制备多抗原表位区相互嵌合的保护性抗原做前期准备，为牛坏死梭杆菌病的预防提供理论基础。在前期试验中，已经得到了牛坏死梭杆菌白细胞毒素基因中的3个主要抗原区，分别为PL1、PL3、PL4，然后根据Genbank发表的牛坏死梭杆菌H05菌株的核苷酸序列克隆出牛坏死梭杆菌溶血素基因全长4107bp的核苷酸序列，并对牛坏死梭杆菌溶血素基因进行截短表达，设计了含有BamHⅠ和XhoⅠ位点的5对溶血素基因截短片段的特异性引物，通过PCR方法扩增出牛坏死梭杆菌溶血素基因相互重叠的5个截短片段，PCR扩增产物经BamHⅠ和XhoⅠ酶切消化后克隆至pET-32a原核表达载体中，之后将5个截短片段的阳性质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，通过PCR方法筛选阳性菌落用来克隆，然后利用IPTG进行诱导表达，表达成功的重组蛋白通过Westernblot技术进行反应原性分析。结果显示，牛坏死梭杆菌溶血素基因5个截短片段中有3个成功获得了表达，分别为Hly-2（第275-567位氨基酸）、Hly-3（第566-888位氨基酸）、Hly-4（第887-1163位氨基酸），并且3个成功表达的重组蛋白均具有反应原性。为了对抗原表位区进行精确定位，剔除非必须基因片段，又进行了以下试验内容：1.根据Genbank发表的牛坏死梭杆菌H05菌株的核苷酸序列克隆出牛坏死梭杆菌溶血素基因截短片段Hly-2、Hly-3、Hly-4及牛坏死梭杆菌白细胞毒素基因截短片段PL1、PL3、PL4；同时根据具核梭杆菌外膜蛋白的核苷酸序列扩增出牛坏死梭杆菌43K外膜蛋白的基因序列，并对克隆出的基因进行再次截短表达，设计了含有BamHⅠ和XhoⅠ位点的特异性引物，其中白细胞毒素12对、溶血素10对、43K外膜蛋白4对，通过PCR方法扩增出各基因相互重叠的截短片段，然后将PCR扩增产物经BamHⅠ和XhoⅠ酶切消化后克隆至pET-32a原核表达载体中。2.将构建成功的截短片段阳性质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，通过PCR方法筛选阳性菌落用来克隆，利用IPTG进行诱导表达，表达成功的重组蛋白通过Westernblot技术进行反应原性分析。结果显示，牛坏死梭杆菌白细胞毒素基因12个截短片段中有10个截短片段成功表达，10个成功表达的重组蛋白中有6个具有反应原性，分别为P3-1（PL3中第1-103位氨基酸）、P3-2（PL3中第97-199位氨基酸）、P3-5（PL3中第383-484位氨基酸）、P3-7（PL3中第576-708位氨基酸）、P4-2（PL4中第105-215位氨基酸）、P4-3（PL4中第209-329位氨基酸）；坏死梭杆菌溶血素基因10个截短片段中有6个截短片段成功表达，6个成功表达的重组蛋白中有2个具有反应原性，分别为H2（hly-2中第98-205位氨基酸）、H9（hly-4中第93-194位氨基酸）；43K外膜蛋白基因4个截短片段均成功表达，4个成功表达的重组蛋白中有2个具有反应原性，分别为43K-1（第19-108位氨基酸）、43K-2（第101-199位氨基酸）。
【作者】吕思文；
【导师】郭东华；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】牛坏死梭杆菌；白细胞毒素；溶血素；外膜蛋白；反应原性分析；

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