猪多杀性巴氏杆菌PlpB与Fur基因融合表达及免疫效果评价

【摘要】猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida,Pm）可引起猪传染性萎缩性鼻炎（Atrophicrhinitis，AR）、猪肺疫和猪呼吸道疾病综合征（Porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC）。由于多杀性巴氏杆菌无宿主特异性，可通过呼吸道进行传播，因此在世界各地广泛存在。随着我国养猪业的快速发展，多杀性巴氏杆菌病的危害性日益凸显，给养猪业造成了巨大经济损失。预防和控制多杀性巴氏杆菌病的最好方法是疫苗免疫，目前防治多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要有灭活苗、弱毒苗和亚单位苗，这些疫苗对巴氏杆菌病的防制起到了一定作用，但由于多杀性巴氏杆菌血清型较多和免疫机制尚不明确，导致至今国内外仍缺乏理想的疫苗。PlpB蛋白为多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白，研究表明在禽多杀性巴氏杆菌病中PlpB表现出良好的交叉保护性。Fur蛋白做为铁摄取调节蛋白，在细菌的生长中起到重要的作用，有研究表明Fur蛋白可抑制生物膜的形成从而达到抑菌的效果，并且可影响相关外膜蛋白的表达。本研究以临床分离鉴定的猪多杀性巴氏杆菌为研究对象，构建了PlpB、Fur及PlpB和Fur串联大肠杆菌重组质粒。利用生物信息学方法结合网络数据库对PlpB与Fur测序结果进行序列分析，预测PlpB、Fur蛋白理化与结构特性。结果表明分离到的多杀性巴氏杆菌为血清型B型的强毒株，对环丙沙星具有高度敏感性。PlpB基因是全长771bp，编码257个氨基酸残基的脂蛋白，其空间结构与创伤弧菌(VibrioVulnificus)的3K2D_A蛋白相似性较高，以此为模板成功构建了可靠的三维结构分子模型。Fur基因是全长432bp，编码144个氨基酸，其空间结构与铁吸收调节蛋白2w57.1.A相似性较高，以此为模板成功构建了可靠的三维结构分子模型。对PlpB与Fur蛋白抗原决定簇进行预测表明这两个蛋白作为抗原表位可能性较大，并且PlpB与Fur蛋白均无跨膜区与信号肽，是相对成熟稳定的蛋白。将构建的三个重组质粒转化到BL21中，诱导表达后可得到56ku的可溶性蛋白GST-PlpB、44ku的包涵体蛋白GST-Fur以及73ku表现为可溶性蛋白也可表现为不溶性的包涵体颗粒融合蛋白GST-PlpB-Fur。Westernblotting印迹检测重组蛋白GST-PlpB、GST-Fur与融合蛋白GST-PlpB-Fur表明这三种蛋白都具有良好的反应原性。将三种蛋白用弗氏佐剂乳化后与全菌灭活疫苗、生理盐水分别免疫小鼠。免疫后用ELISA方法检测血清中IgG、IFN-γ和IL-4含量，并通过攻毒试验评价三个亚单位疫苗与一个全菌灭活苗的免疫效力。结果表明全菌灭活苗免疫效果最优，与其它三个亚单位疫苗差异均极显著，GST-PlpB-Fur融合蛋白苗免疫效果优于GST-PlpB与GST-Fur重组蛋白苗，Fur与PlpB蛋白在免疫效果上起到协同作用。本研究为今后开展猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的开发，毒力因子交叉保护性能的研究以及铁调节基因在细胞中的作用等研究奠定了基础。
【作者】蒋惠婷；
【导师】倪宏波；王春来；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，兽医，2014，硕士
【关键词】猪多杀性巴氏杆菌；PlpB；Fur；生物信息学；免疫效果；

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