副猪嗜血杆菌主要保护性抗原的免疫效力评价

【摘要】副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）是健康猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定条件下侵入机体而引起革拉瑟氏病（Glsser’sdisease），以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，对养猪业危害严重并造成巨大的经济损失。HPS血清型众多，有很多无法定型的菌株，不同血清型之间的交叉保护力差，所以商品化疫苗在目前不能起到良好的保护作用，这与HPS毒力因子未知以及保护性抗原认识不清楚有一定关系。目前单价和多价灭活苗用于预防和治疗HPS，但效果并不理想。有文献报道，亚单位疫苗对防治HPS具有很好的前景和潜力。因此，本研究对HPS主要保护性抗原进行免疫效力评价，筛选疫苗候选抗原，以期为HPS的亚单位疫苗的研制和副猪嗜血杆菌病的诊断奠定基础。自转运三聚体蛋白VtaA与HPS的毒力有关。在HPS血清5型Nagasaki株基因组中共有13个拷贝的vtaA基因，其中vtaA1基因与其它拷贝等具有较高的同源性。本研究将vtaA1基因编码序列分段进行表达，即N端vtaA1N、C端vtaA1C和中间区段vtaA1M。HktE（过氧化氢酶）和AfuA（Fe3+转运蛋白）是本实验室利用免疫蛋白质组学方法筛选鉴定到的两个抗原蛋白。以HPS血清5型Nagasaki基因组为模板，通过PCR扩增，酶切连接将目的基因克隆到原核表达载体pET28a(+)。经鉴定正确的的阳性质粒pET-afuA、pET-hktE、pET-vtaA1C、pET-vtaA1M、pET-vtaA1N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导，优化反应温度和反应条件并表达出目的蛋白，大小与预期结果相符。其中HktE和AfuA以可溶形式表达，VtaA1C，VtaA1M，VtaA1N以包涵体形式表达。然后利用镍离子螯合层析技术对重组蛋白进行纯化。由于VtaA1N表达量低，无法纯化。其余四种蛋白均通过此方法获得了较高纯度的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明，重组蛋白具有良好的反应原性。用纯化好的AfuA，HktE，VtaA1C,VtaA1M重组蛋白及本实验室已经构建并纯化好的其余6种蛋白OppA，HbpA，HPS-04307，CdtA，CdtB，CdtC，以100μg/只免疫4-6周龄雄性昆明小鼠，第二次免疫15d后使用间接ELISA测定抗体滴度和细胞因子的检测。MTT试验检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。用HPS血清5型、13型强毒株进行攻毒保护性试验。结果表明，10种重组蛋白都可以诱导小鼠体内较高水平的抗体滴度，淋巴细胞增殖试验结果表明，免疫组均可产生明显的细胞免疫，IL-2、IL-4、IFN-γ在免疫后均有显著提高。其中OppA，CdtC，CdtA，CdtB，AfuA，HktE，VtaA1C，VtaA1M蛋白能提供较高的保护力并有作为候选抗原蛋白的潜力，为HPS亚单位疫苗的研制奠定了基础。
【作者】刘娇；
【导师】倪宏波；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】副猪嗜血杆菌；保护性抗原；免疫效力评价；

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