牛产气荚膜梭菌α-ε融合基因的构建、表达及免疫原性研究

【摘要】牛产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens,Cl.perfringens）引起的疾病以A型多发，被认为是“牛猝死症”（SuddenDeathSyndrome，SDS）的主要病原。近年来多见D型菌导致牛肠毒血症（Bovineenterotoxemia）的报道，因该病发病急、病程短、死亡率高，给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。A型和D型产气荚膜梭菌主要产生α毒素和ε毒素。研究表明这两种毒素均为产气荚膜梭菌的主要免疫原，可刺激动物机体产生特异性的保护性抗体。本研究拟通过大肠杆菌克隆并表达出具有一定生物学活性的α毒素蛋白、ε毒素蛋白以及α-ε融合蛋白。首先，PCR分别扩增出A型产气荚膜梭菌的α毒素基因和D型产气荚膜梭菌的ε毒素基因，将两基因分别插入到pET-28a质粒中。与此同时，利用相同酶切位点连接的方法构建含有α-ε融合基因的重组pET-28a质粒。所有构建好的重组质粒经酶切和测序鉴定正确后，分别转化入BL21(DE3)PlysS中，IPTG诱导，用SDS-PAGE和Westernblotting检测表达蛋白。采用镍柱亲和层析的方法纯化蛋白，制备成疫苗进行小鼠免疫，用ELISA检测血清抗体水平和细胞因子分泌情况，最后进行攻毒试验。结果，成功构建并表达出具有生物学活性的α毒素蛋白、ε毒素蛋白和α-ε融合蛋白。ELISA检测结果三种蛋白免疫后小鼠均出现明显的抗体消长曲线，并于二免二周后达到峰值。分泌IL-4和IFN-γ的细胞数与对照组相比，显著升高（p<0.05）。A型产气荚膜梭菌攻毒组α毒素蛋白、α-ε融合蛋白和对照组的免疫保护率分别为70%、80%和0%；D型产气荚膜梭菌攻毒组α毒素蛋白、ε毒素蛋白、α-ε融合蛋白和对照组的免疫保护率分别为60%、60%、90%和0%。综上所述，本实验成功将α毒素蛋白、ε毒素蛋白和α-ε融合毒素蛋白进行原核表达。用三种蛋白免疫动物后均可使动物产生较高的血清抗体水平，可抵抗1MLD的A型和D型产气荚膜梭菌的攻击，相对于单独表达的蛋白，融合蛋白表现出其优越性。该研究为今后进一步研制预防牛多型产气荚膜梭菌感染的多价基因工程亚单位疫苗提供了新思路。
【作者】尹辉；
【导师】朱战波；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】牛产气荚膜梭菌；α毒素；ε毒素；基因融合；免疫；

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