玉米弯孢叶斑病菌Ras同源蛋白Clg2p基因的功能研究

【摘要】由新月弯孢［Curvularialunata(Wakker)Boed.］引起的玉米弯孢叶斑病已成为我国玉米主产区的重要病害之一，给玉米生产带来了严重的损失，因此深入研究该病原菌的致病分子机理对于防治该病有重要意义。植物病原真菌主要存在三条信号途径（MAPK途径、cAMP途径和Ca2+途径）调控病菌的生长、发育和致病性。其中Ras蛋白位于MAPK途径的上游，它可以与效应分子结合参与PKC和MAPK途径，调控病原菌菌丝生长和附着胞的形成。本研究根据前期的全长cDNA文库中获得一条与Ras蛋白同源的EST序列，克隆和探讨该基因在致病性中的功能和可能的调控机理，其结果如下：1.采用PCR技术克隆了一个基因，其DNA全长为951bp，读码框为678bp，含有4个外显子及2个内含子，共编码225个氨基酸，并以单拷贝的方式存在于基因组中，将其命名为Clg2p，基因登陆号为HQ655805；2.利用SOEPCR法构建具有潮霉素基因的敲除载体，通过PEG介导转化的方法将载体导入原生质体中，采用同源重组原理实现基因敲除从而获得转化子。设计特异性引物对转化子进行PCR、RT-PCR和Southernblot检测，获得了Clg2p基因敲除突变体；3.通过对野生菌和Clg2p基因敲除突变体在菌落、分生孢子以及附着胞的形态、菌落生长速度、产孢率以及孢子萌发率等生物学方面的比较，结果发现Clg2p基因敲除突变体产生较多的白色气生菌丝、生长速度在培养初期缓慢且易受低温抑制、孢子萌发和产量明显下降、分生孢子和附着胞的形态发生变化。进一步通过荧光定量分析发现Clg2p基因在孢子萌发3h时表达量最高，此时是分生孢子萌发产生附着孢和开始侵染寄主的过程，结果表明Clg2p基因影响病菌侵染器官的形成，调控着分生孢子、附着胞形成与菌丝生长；4.通过对离体叶片接菌实验、细胞壁降解酶和尿酸酶活性的分析、细胞壁完整性、H2O2以及胁迫渗透影响等试验，观察到突变体致病力和抗胁迫渗透能力下降且尿酸酶活性降低；5.为了进一步明确Clg2p的调控功能，采用RNA-Seq技术对该病菌野生型DQ-1和Clg2p基因突变体两个样本进行转录组测序，拼接后分别得到cleanreads为19598078和20009378，比较两个样本的差异表达情况，发现共有1479个差异表达基因，其中有608个基因上调以及871个基因下调，对差异表达基因的GO分析表明共有3792个DEGs注释到145个GO条目，生物学过程中最多的是代谢过程、细胞组中最多是细胞、分子功能中最多的是抗催化活性条目，Pathway富集分析表明，共有138个DEGs富集于68个代谢通路，主要参与到营养物质代谢等通路。通过以上结果分析表明Clg2p基因处于一个复杂的网络调控途径中，它可能通过多种途径或者多种方式来调控病原菌的一些生物学特征和致病性，但要明确Clg2p在网络调控中处于何种地位，是如何通过某种和几种基因互作调控着这些生物学功能还需要进一步的研究。
【作者】马炳辰；
【导师】左豫虎；刘铜；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，植物病理学，2014，硕士
【关键词】玉米弯孢叶斑病菌；Ras蛋白；Clg2p基因；基因敲除；转录组；

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