基于免疫彩色二氧化硅微球新型凝集技术研究

【摘要】对致病微生物及其毒素等有害物质更好的快速检测方法和技术是保障对其污染食品和感染实施有效监测、监管、质控、预防和及时诊断的必要条件,也是相关检验检疫部门的需求和有关研究人员研究的热点。在多种快速检测技术中,凝集试验(Agglutinationtest)因其具有操作简便易行、不需特殊贵重仪器和结果判断直观等优点,在食品安全、兽医学和医学等领域被各级检验检疫部门广泛使用,其中间接凝集试验(Indirectagglutinationtest)因为有载体加入而较直接凝集实验更加敏感和易于判别检测结果。间接凝集实验所用载体对其性能有重要影响,常规用载体有绵羊红细胞和聚苯乙烯乳胶微球两种,前者与抗体结合能力较好,且具有较鲜艳红色,利于检测结果判断,但其稳定性较差,处理并标记好的红细胞也不够稳定,易发生溶血,也易被污染,难长时间保存；聚苯乙烯乳胶微球经济、易得,比红细胞稳定,但也较易溶胀破裂,且与蛋白的结合能力及凝集性能都较差,本身无色,用其作载体的凝集结果也不利观察；再有,用这两种载体检测都只能同时检测一种抗原。因此,寻找更加理想的载体是改进间接凝集实验的关键因素。随着纳米技术和生物技术的不断发展,将纳米颗粒与生物测定方法相结合用于致病菌检测越来越受到人们的关住,使用纳米材料修饰和标记生物抗体,制备免疫纳米微球,已被广泛应用到致病菌的检测当中。本论文使用反相微乳体系制备彩色二氧化硅微球(ColoredSilicaNanoparticles,CSN),再通过化学交联法将抗体修饰到彩色二氧化硅微球表面制备得到免疫彩色二氧化硅微球(ImmuneColoredSilicaNanoparticles,ICSN),并基于ICSN构建新型凝集技术用于致病菌的快速检测。通过该新型凝集技术可以实现一次性对一种或两种及更多种食源性致病菌的快速、灵敏和准确的检测。本论文主要从以下几个方面展开了研究：1单分散免疫彩色二氧化硅微球(ICSN)的制备研究以反相微乳液法为基础,采用正己烷作溶剂,正硅酸乙酯(TEOS)在氨水催化下发生水解缩聚反应,在硅烷偶联剂存在的条件下,生成的二氧化硅微球被修饰上有机活性染料得到彩色二氧化硅微球(Coloredsilicananoparticles,CSN)。通过实验系统地研究了反应条件对成球粒径及单分散的影响,用场发射扫描电镜SU-70和Nano2S激光粒度电位仪对样品的形貌和粒度进行了表征。结果表明,在其他条件不变的情况下,随正硅酸乙酯和氨水量的增大,生成的二氧化硅微球的粒径逐渐增大；水的量和温度的变化对微球的粒径和分散度影响较大。另一方面,向反应体系中加入硅烷偶联剂KH-550可以有效减小微球之间的团聚,并增大了有机活性染料对微球的染色效果,从而为制备单分散彩色二氧化硅微球提供了有效的方法。论文中还讨论了相关的反应机理,根据这些反应条件的变化可以确定制备不同粒径的单分散彩色二氧化硅微球所需的最优条件。在最优反应条件下制备得到CSN,将合成好的CSN与致病菌抗体孵育结合,制成ICSN,以用于食源性致病菌的快速检测。2快速检测鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌新型凝集技术研究为探求鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌快速检测的新型凝集技术,本研究尝试用三种有机活性染料与抗体分别修饰二氧化硅活性微球制成ICSN,构建快速检测鸡白痢鸡伤寒沙门菌新型凝集技术。利用第一部分所讨论的反相微乳法首先制备CSN,用扫描电镜表征其形貌特征和分散程度,通过凝集现象表征ICSN对鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌的检测效果。结果表明该新型凝集技术：灵敏度好,其凝集结果醒目、直观、易于肉眼判别,且耗用抗体不到常规凝集试验的1/500,对目标菌的检测范围为102-109cfu.mL-1；重复性和稳定性好,4℃放置28d后,凝集效果与放置前无显著差异；具有较好的特异性和准确性。因此,用ICSN构建的新型凝集技术具有灵敏、经济、稳定、简便、快速、准确等优点,适用于鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌的快速检测。3快速检测阪崎肠杆菌新型凝集技术研究为探求快速检测阪崎肠杆菌的新型技术,本研究尝试用有机活性染料与阪崎肠杆菌抗体共修饰二氧化硅活性微球制成对阪崎肠杆菌有特异性的免疫彩色二氧化硅微球(ImmuneColoredSilicaNanoparticles,ICSN),构建快速检测阪崎肠杆菌新型凝集技术。首先利用反相微乳法制备彩色二氧化硅微球(ColoredSilicaNanoparticles,CSN),用扫描电镜表征其形貌特征和分散程度,通过凝集现象评估对阪崎肠杆菌的检测效果。结果表明该新型凝集技术：灵敏度高,对目标菌的检测范围为102～109cfu·mL-1,其凝集结果醒目、直观、易于肉眼直观判别；重复性和稳定性好,且具有好的特异性和准确性。22-37℃的条件下出现凝集现象较快,仅为20-30s。用ICSN构建的新型凝集技术具有灵敏、快速、稳定、简便、准确、经济等优点,不仅适用于快速检测阪崎肠杆菌,还可为其它食源性致病微生物快速检测提供研究基础模型,具有较好的应用前景。4基于ICSN同时快速检测多种致病菌新型凝集技术的研究本章尝试用制备好的红色和橙黄色的单分散彩色二氧化硅微球(ColoredSilicaNanoparticles,CSN)作为载体,制备两种免疫彩色二氧化硅活性微球(ImmuneColoredSilicaNanoparticles,ICSN)。先对这两种CSN进行羧基活化后再分别修饰鸡白痢抗体和阪崎肠杆菌抗体,最后将其进行混合制成对两种致病菌都有特异性的ICSN混合溶液。对鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌和阪崎肠杆菌的混合悬菌液进行检测。结果表明,该新型凝集技术检测速度快,仅20-30s即可出现清晰的凝集现象,并通过凝集块显示的颜色快速检测出两种致病菌。基于ICSN构建了一种一次可以同时快速检测多种致病菌的新型凝集技术,该技术更加直观、灵敏、经济、准确、稳定、简便,在食品安全、医学、兽医学、环境等领域都具有良好的应用前景,其创新性较好。
【作者】杨磊；
【导师】赵广英；窦文超；
【作者基本信息】浙江工商大学，食品科学与工程，2013，硕士
【关键词】免疫彩色二氧化硅微球；新型凝集技术；快速检测；鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌；阪崎肠杆菌；

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