甘油合成关键酶基因的克隆表达及其应用

甘油合成关键酶基因的克隆表达及其应用

作者:师大云端图书馆 时间:2017-03-14 分类:硕士论文 喜欢:3578
师大云端图书馆

【摘要】甘油不仅是生物中重要的功能物质,而且是一种重要的三碳醇类平台工业化合物,具有广泛的应用价值,在国防,医药,食品等行业都有重要的作用。近年来,甘油作为生产高附加值化合物的原料,如1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、环氧氯丙烷、聚羟基脂肪酸酯(PHA)等,而备受关注,其中1,3-丙二醇是世界公认的12种最有潜力的重要工业材料,可与对苯二甲酸聚合形成新型的聚酯材料PTT,是国际研究热点。本文在江南大学工业微生物与生物工程反应中心获得的产甘油假丝酵母基础上对甘油合成关键酶基因进行克隆和不同宿主的表达,并对其在1,3-丙二醇生物合成中的应用进行探索。本研究利用PCR方法,分别以产甘油假丝酵母和酿酒酵母染色体DNA为模板,克隆获得3-磷酸甘油脱氢酶编码基因CgGPD和3-磷酸甘油酯酶编码基因ScGPP2,在对这两个关键基因的生物学信息进行了一系列分析的基础上,构建表达重组质粒pEtac-CgGPD,pEtac-ScGPP2和pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2。将所构建的表达重组质粒pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2转入E.coliJM109,获得重组菌E.coliJM109(pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2);经IPTG的诱导,SDS-PAGE电泳检测,表明重组蛋白表达正确;酶活性测定表明:与野生菌株中没有检测到相应的酶活相比,重组大肠杆菌中3-磷酸甘油脱氢酶酶活力为0.06U/mg蛋白,3-磷酸甘油酯酶酶活力为0.01U/mg蛋白;重组菌胞外被检测到甘油说明来源于酵母的甘油合成途径已成功构建于原核生物大肠杆菌中。以此研究结果为基础,将所获得的甘油合成关键基因CgGPD和ScGPP2转入产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌株中,构建可利用葡萄糖为底物的产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌(K.pneumoniae/pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2),经SDS-PAGE检测和酶活测定,结果表明,两个甘油合成基因在克雷伯氏菌中都成功表达,重组菌3-磷酸甘油脱氢酶酶活力为0.1U/mg总蛋白,3-磷酸甘油酯酶酶活力为0.02U/mg总蛋白;野生对照菌株中没有这两个蛋白的酶活性,表明该甘油途径在克氏工程菌中有效存在。对所构建的克雷伯氏重组菌株(K.pneumoniae/pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2)发酵生产1,3-丙二醇的性能进行了初步的考察。结果表明在以葡萄糖为底物发酵时,发酵液中一定量的甘油积累,可以诱导1,3丙二醇合成途径的启动。对克雷伯氏重组菌株生产1,3-丙二醇的发酵性能进行优化,表明糖浓度提高1%,1,3-丙二醇的产量增加了2.15倍。补加1%的甘油发酵结果表明,在以葡萄糖为唯一碳源的一步法生产1,3-丙二醇的发酵中,一定浓度的甘油,可以快速启动1,3-丙二醇的合成途径,缩短发酵周期,节省成本。通过对重组菌K.pneumoniae(pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2)和野生克雷伯氏菌碳流代谢分析进一步证实:3-磷酸甘油脱氢酶基因(CgGPD)和3-磷酸甘油酯酶基因(ScGPP2)的加入,在克雷伯氏菌中搭建了一座桥梁,使磷酸二羟丙酮转化为克雷伯氏菌可以利用的底物甘油,成功的完成了葡萄糖到甘油的代谢转化,从而为葡萄糖到1,3-丙二醇的合成提供了一种潜在的工艺路线。
【作者】刘小红;
【导师】陈文强;诸葛斌;
【作者基本信息】陕西理工学院,植物学,2014,硕士
【关键词】3-磷酸甘油脱氢酶;3-磷酸甘油酯酶;克隆;肺炎克雷伯氏菌;1,3-丙二醇;

【参考文献】
[1]娄柯,崔宝同,李纹.基于蜂拥控制的移动传感器网络目标跟踪算法[J].控制与决策,2013,11:1637-1642+1649.
[2]吴师鹏,欧阳为民,陈宁宇,徐春荣.基于图的数据挖掘在入侵检测系统中的应用[J].计算机工程与设计,2005,06:1651-1653.
[3]刘书武.锂离子电池负极材料—低温碳化微球的制备及其改性研究[D].江西师范大学,2014.
[4]李亮.基于B/S模式的宾馆管理系统的设计与实现[D].燕山大学,计算机技术,2012,硕士.
[5]刘坚.空区存窿矿石细菌浸出室内试验研究[J].有色金属(矿山部分).2005(01)
[6]张海涛.足式机器人可变刚度柔性关节的研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[7]戴建旺,徐建新,何禾.县(市)级土地利用数据库建设技术方法及成果应用[J].中国土地科学,2002,03:46-48.
[8]徐兴英.功能化氧化石墨烯的制备及其载药性能[D].青岛科技大学,2012.
[9]顾润红.综放采空区3D空间非线性渗流及瓦斯运移规律数值模拟研究[D].辽宁工程技术大学,安全管理工程,2012,硕士.
[10]苗雨.《庄子》内篇“游”之观念的跨文化阐释[D].北京外国语大学,比较文学与世界文学,2014,硕士.
[11]陆洁.人的全面发展视野下职业院校思想政治教育研究[D].青海师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[12]杨洁琼.中小学生对科学家形象和科学认识的调查研究[D].杭州师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[13]仲崇福.五种流派太极拳的文化认同研究[D].河北师范大学,民族传统体育学,2014,硕士.
[14]欧思源.计及输电风险的区域电网经济调度应用研究[D].广东工业大学,电气工程,2014,硕士.
[15]李长伟.路易斯酸催化的酰化-Nazarov环化串联反应及其在有机合成中的应用[D].郑州大学,有机化学,2013,硕士.
[16]黄超.山西省农民专业合作社融资现状及影响因素研究[D].山西财经大学,会计学,2014,硕士.
[17]李平宝.VVI和DDD不同起搏模式对SSS患者心功能的影响[D].广州中医药大学,中西医结合临床(专业学位),2013,硕士.
[18]李立国.现代企业员工绩效考评体系研究[D].武汉理工大学,思想政治教育,2004,硕士.
[19]李多.梅—萨模型下城市最低生活保障政策的执行问题研究[D].辽宁大学,行政管理,2012,硕士.
[20]秦政.新型冷轧带钢板型仪SI-FLAT在冷连轧机的应用[J].冶金自动化,2004,02:63-65.
[21]王建蓉.多车道下低速货车对通行能力的影响机理研究[D].上海理工大学,交通运输规划与管理,2012,硕士.
[22]顾婷.基层信访工作的困难及应对措施[D].华东理工大学,公共管理(专业学位),2013,硕士.
[23]路丽.构建公安执法人员管理系统探究[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[24]杨小云.数字图书馆中数据挖掘研究[J].延安教育学院学报,2005,02:77-78.
[25]吕娉娉.艾蒿超细粉体/纤维素共混膜的制备[D].青岛大学,纺织化学与染整工程,2013,硕士.
[26]潘孝楠.基于云制造的服装生产管理技术研究与应用[D].复旦大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[27]翟洪波.碳纳米管/聚合物复合涂层制备与表面特性[D].大连海事大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[28]茹薏.外汇储备对我国货币政策的影响分析[D].苏州大学,金融学,2014,硕士.
[29]邓垚彪.一种透明访问远程内存系统的设计和实现[D].湖南大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[30]张帅.海洋观测网络化智能接口模块设计研究[D].国家海洋技术中心,港口、海岸及近海工程,2013,硕士.
[31]王刚.共轭分子推拉电子基团间桥键含氮量变化对电存储器件性能影响研究[D].苏州大学,有机化学,2014,硕士.
[32]冯惠芬.对库内密闭除湿的可行性探讨[J].档案学研究.1989(03)
[33]李军,张军华,韩双,朱文博,杨勇,杜玉山.火成岩储层勘探现状、基本特征及预测技术综述[J].石油地球物理勘探,2015,02:382-392+8.
[34]徐春丽.基于动态概率关系模型的规划识别研究及应用[D].江苏科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[35]胡月圆.表达自由的法律研究[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[36]刘丽华.初中语文知情共育教学研究[D].内蒙古师范大学,教育(专业学位),2013,硕士.
[37]王琳.当代中国共产党人共同富裕思想研究[D].北京交通大学,2014.
[38]刘芯言,彭翃杰,黄佳琦,张强,魏飞.碳纳米管在柔性储能器件中的应用进展[J].储能科学与技术,2013,05:433-450.
[39]刘玉琼.大职教观下区域职教管理体制变革研究[D].湖南农业大学,中职,2012,硕士.
[40]王重阳.两种剂量丙种球蛋白联合甲泼尼龙治疗重症ITP的临床研究[D].延安大学,内科学,2014,硕士.
[41]许丽英.水+四氢呋喃+萃取剂体系汽液平衡性质研究[D].浙江工业大学,2012.
[42]杨嘉龙.优化长春市汽车产业结构问题研究[D].吉林大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[43]魏兰.以木质素为原料合成环氧树脂的研究[D].天津科技大学,制浆造纸工程,2004,硕士.
[44]黄炯媚.缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护作用及对肾小管钠/氢交换蛋白3表达的影响[D].遵义医学院,生理学,2012,硕士.
[45]张瑜.论我国物流园区的规划与发展[D].对外经济贸易大学,国际贸易,2004,硕士.
[46]陈启蒙.基于ArcGIS的水上综合监控系统的研究[D].大连海事大学,航海科学与技术,2013,硕士.
[47]李婉.精神分析的中国之旅(1914-1949)[D].河北师范大学,文艺学,2014,硕士.
[48]朝鲁门格日乐.对外汉语教学中文化因素导入方法研究[D].苏州大学,汉语国际教育(专业学位),2014,硕士.
[49]康南昌.阿尔金断裂系与塔中构造带的形成与演化[J].石油地球物理勘探,2002,01:48-52+98.
[50]王冉.基于FPGA的雷达欺骗干扰信号的中频模拟[D].北方工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.

相关推荐
更多