青虾泛素特异性蛋白酶9基因（Usp9）全长cDNA克隆及时空表达分析

【摘要】青虾,学名日本沼虾(Macrobrachiumnipponense),是一种广泛分布于我国淡水水域的主要经济虾类。青虾雌雄个体之间的生物学或者经济性状存在显著差异,如性成熟的雄虾个体明显大于同龄的雌虾,雄虾的生长速度也远大于雌虾。因此,青虾的性别决定和性别控制研究具有重要的学术价值和生产意义。有研究表明,泛素特异性蛋白酶9(ubiquitin-specificprotease9,Usp9)在褐家鼠中与X染色体连锁,并且发现其在雌雄脑表达有明显的性别差异,同时该基因在神经系统中参与epsin蛋白去泛素化的过程,与神经细胞的分化和突触的形成有关。Usp9基因的克隆和表达分析在甲壳动物中尚未有相关报道。本文从本实验室构建的青虾精巢文库中筛选到褐家鼠(Rattusnorvegicus)“泛素特异性蛋白酶9基因”的同源序列,采用快速扩增cDNA末端(rapid-amplificationofcDNAends,RACE)技术首次克隆了青虾“泛素特异性蛋白酶9基因”(Usp9)的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1217bp,包括978bp的开放阅读框(ORF)、120bp的5’非编码区(UTR)和116bp的3’UTR,并且3’端存在Poly(A)尾巴。基因共编码326个氨基酸多肽前体,预测蛋白质分子量为36.53kDa,理论等电点PI为5.32。氨基酸序列分析发现Usp9的蛋白没有信号肽及跨膜区域,表明它是在细胞核内起作用。氨基酸序列比对分析显示,青虾Usp9蛋白与太平洋牡蛎(Crassostreagigas)、凤仙花熊蜂(Bombusimpatiens)及灰短尾负鼠(Monodelphisdomestica)的蛋白相似度分别为99%、97%和95%。系统进化树分析表明,青虾Usp9基因的氨基酸序列与同属甲壳纲的钩额型蚤状溞(Daphniapulex)进化关系最近而聚为一支。采用荧光定量PCR技术检测了Usp9基因的时空表达,水温28℃时,Usp9基因在青虾发育的后幼体发育期第五天PL5出现表达高峰。Usp9基因在6种成体组织中均有表达,表达水平依次为：脑>腹神经>精巢>卵巢>肌肉>肠。而在雌雄组织差异表达分析表明,精巢中Usp9基因表达量比卵巢的比值为2.86,脑组织中雄虾的表达量比雌虾为2.27,差异均为极其显著(P<0.01)。本研究首次克隆得到了青虾Usp9基因的全长cDNA序列,对其结构特征进行了分析,并首次采用荧光定量PCR技术分析了该基因在青虾胚胎发育、幼体发育和幼虾发育的不同时期和成体组织的时空表达差异,这也是Usp9基因在甲壳动物研究中的首次报道。结果显示Usp9基因在神经系统中发挥作用,且与雄性偏向基因雌雄表达差异趋势一致(雄性表达：雌性表达≥1.5)。本研究为进一步开展青虾Usp9基因功能等相关研究奠定了基础,并可为青虾性别的遗传调控机制研究提供参考。
【作者】袁晖；
【导师】傅洪拓；
【作者基本信息】南京农业大学，水产养殖，2013，硕士
【关键词】青虾；泛素特异性蛋白酶9；基因克隆；基因表达；性别决定；

【参考文献】
[1]郭雨春.“京唐钢铁公司环境信息管理系统”通过验收[J].冶金自动化,2013,04:48.
[2]周婧.国企资产置换之法律规制[D].华中师范大学,经济法,2014,硕士.
[3]庞露露.安徽国土资源信息服务平台建设研究[D].安徽大学,情报学,2013,硕士.
[4]梁敏慧1,渠岩2,崔亚娟2,李全霞2,陈兆天2,李东2.超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定配方奶粉中的生物素含量[J].食品科学.
[5]秦洪伟.原位细胞电化学检测方法及对氯酚类污染物的毒性测定研究[D].东北师范大学,环境科学,2014,博士.
[6]杨丽娜.西安PAS系统网络改造的研究[D].西安理工大学,电气工程,2003,硕士.
[7]吴晓春.加快e网建设改善金融统计[J].华南金融电脑,2005,02:53-54.
[8]龚柯菱.全固态高功率板条放大器关键技术的研究[D].北京交通大学,2014.
[9]卞国凤.范仲淹宗族福利思想研究[D].吉林大学,社会学,2004,硕士.
[10]李健.酸酶法水解稻草纤维素发酵酒精初探[D].江西农业大学,微生物学,2012,硕士.
[11]綦举胜.基于车辙试验的沥青混合料高温稳定性评价指标研究[D].内蒙古农业大学,森林工程,2012,硕士.
[12]高妍妍.联合应用IVM和TCBZ在蠕虫感染绵羊体内的动力学相互作用研究[D].内蒙古农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[13]朱卉.6例卵巢癌CT误诊病例分析[D].苏州大学,妇科（专业学位）,2013,硕士.
[14]唐文献.KBE环境下面向协同创新的产品开发支持系统研究[D].上海大学,2003.
[15]褚卫东,胡小静.用“两化”提升三北工程经济效益[J].绿色中国.2005(11)
[16]李拥军,高学东.钢铁企业营销分析数据仓库主题、维、粒度的确定方法[J].冶金自动化,2005,05:16-20.
[17]朱辉.数字接收机并行定时同步的研究与实现[D].华中科技大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[18]徐顺建,黄勇,钟炜,肖宗湖,罗永平,欧惠.交联孔隙结构TiO_2-PEDOT:PSS纳米复合薄膜的制备及作为对电极的应用[J].光学学报,2014,09:334-340.
[19]贾舒.利用天然anti-Rhamnose抗体增强机体对肿瘤细胞的识别与杀伤[D].山东大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[20]韩艳星.功能化碳微球自组装膜的研究[D].太原理工大学,2011.
[21]高学钦.五代时期十国与中原王朝的政治关系研究[D].福建师范大学,中国古代史,2004,硕士.
[22]杨光富.美国赠地学院发展研究[D].华东师范大学,教育史,2004,硕士.
[23]高欣佳.基于水权束重组模型的浙江省水资源流转实践解读[D].浙江工商大学,产业经济学,2012,硕士.
[24]牛杰.沙曲煤矿井上下钻孔对接预抽煤层瓦斯技术效果分析与评价[D].中国矿业大学,安全技术及工程,2014,硕士.
[25]王二毛,司景萍,李海港,赵宇楠.基于Pro/E和ADAMS的自卸系统仿真及车厢受力分析[J].公路与汽运,2015,02:27-31.
[26]李子峰.中国画改良与守护[D].中国艺术研究院,美术学,2013,硕士.
[27]彭军.低温溶液法制备的氧化铝在有机光电器件中的研究[D].苏州大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[28]陈颖,徐宝梁,苏宁,王媛,王丙武,葛毅强.实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立[J].食品与发酵工业.2003(08)
[29]赵哲.基于嵌入式的平面无线调车设备的检测系统设计[D].北京交通大学,智能交通工程,2013,硕士.
[30]杨星兰.A民营快递企业的物流能力研究[D].北京交通大学,2013.
[31]沈世慧.基于中国电信网络的平安城市方案设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[32]张彪.2-丁氧基-3，4-二氢吡喃与双位点亲核试剂开环反应的研究[D].华中科技大学,物理化学,2013,硕士.
[33]文婷.大学生健康网络人格培育研究[D].湖南科技大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[34]屈晗.TD-SCDMA基站智能天线校正设计及实现[D].西安电子科技大学,软件工程,2009,硕士.
[35]王爱军.马铃薯干腐病和黑痣病菌拮抗芽孢杆菌的筛选及芽孢杆菌遗传多样性研究[D].甘肃农业大学,植物病理学,2013,硕士.
[36]王娜.适应国家电子政务发展要求全面推进审计信息化建设——全国审计工作座谈会权威聚焦[J].中国审计,2004,15:10-16.
[37]包凌宇.“民族骨干”硕士生基础培训阶段存在的问题及对策研究[D].西南大学,教育学原理,2014,硕士.
[38]罗林英.Acrobot镇定控制策略研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[39]张龙辉.高压开关柜光纤温度实时监测软件平台开发[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[40]张正雨.石板拱桥拓宽改造技术研究[D].重庆交通大学,建筑与土木工程,2012,硕士.
[41]陈龙平.蔗渣黑液预煮烧碱-CT-1助剂法制浆与全无氯漂白的研究[D].广西大学,制浆造纸,2004,硕士.
[42]孙多.我国食品安全检测问题研究[D].东北师范大学,行政管理,2012,硕士.
[43]史风梅.废镍镉电池中镉的回收及资源化研究[D].青岛大学,环境科学,2004,硕士.
[44]包呼宝力高.八思巴字印章体研究[D].内蒙古大学,中国少数民族语言文学,2014,硕士.
[45]汤同芳.超高超大悬挑结构健康监测研究[D].安徽建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[46]罗亭.城镇有机垃圾热解生物炭理化性质研究[D].重庆大学,环境工程,2014,硕士.
[47]罗适.古典时期雅典与波斯军事外交关系研究[D].山西师范大学,世界史,2013,硕士.
[48]王毅.网络处理器包传输结构的研究[D].西北工业大学,计算机系统结构,2004,硕士.
[49]王银锋.一些拓扑兴趣的分子笼、篮和瓶的结构和性质[D].吉林大学,2010.
[50]赖光金,熊智斌.近八年高校高尔夫教育现状研究综述[J].老区建设,2014,18:50-52.