黄瓜营养体苦味基因Bi的克隆及功能解析

【摘要】黄瓜是世界性的重要蔬菜作物之一,在全球蔬菜供应中具有举足轻重的地位。然而在黄瓜生产上,特别是在保护地条件下,由于遗传因素及栽培管理和技术使用不合理,会使果实产生苦味,导致收益损失。黄瓜的苦味是由一类称为苦味素或葫芦素C(CucurbitacinsC)的物质引起的,Bi基因控制着黄瓜营养体中苦味,Bt基因控制着果实中的苦味,bi基因与Bt基因存在互作效应,纯和基因型bibi对Bt具有隐性上位作用。研究黄瓜营养体及果实中苦味基因的遗传规律及葫芦素C合成代谢过程中的关键基因,明确苦味形成的分子机理对于指导育种工作者正确选择选配亲本、进行无苦味黄瓜的分子标记育种具有重要意义。黄瓜(CucumissativusL)全基因组测序完成后,借助黄瓜高密度遗传图谱和高分辨率作图,将Bi基因定位在六号染色体约35Kb的物理区间。本研究通过比较基因组学找到并克隆了Bi候选基因Csa680,通过酵母、烟草表达系统以及遗传转化对Csa680基因进行功能研究,最终确定了Csa680基因具有环化酶功能,Csa680蛋白作用于2,3-氧化角鲨烯,生成葫芦二烯醇,Csa680基因在葫芦素C合成工程中起着关键作用,即Csa680基因为Bi基因。主要研究结果如下：(1)Bi基因的克隆：通过比较基因组学分析,在黄瓜中找到了四个环化酶：Csa846、Csa507、Csa680、Csa845,将这四个环化酶与拟南芥和西葫芦中的环化酶进行系统发育分析,发现Csa680基因跟西葫芦(Cucurbitapepo)葫芦二烯醇合成酶(CPQ)同源性高达90%。(2)酵母表达系统：构建酵母表达载体pYES2-Csa680,经酵母转化、诱导后,通过碱裂解法提取酵母中代谢产物,进行GC-MS检测,验证了Csa680基因具有环化酶功能,Csa680蛋白能催化2,3-氧化角鲨烯环化,形成葫芦二烯醇。(3)烟草瞬时表达：构建植物表达载体PCAMBIA1300-Csa680,通过农杆菌介导将Csa680基因导入植物细胞中,经瞬时表达,产生有功能的Csa680蛋白,Csa680蛋白作用于氧化角鲨烯,使其环化产生葫芦二烯醇,通过此实验证明了Csa680基因具有环化酶功能。(4)遗传转化：构建植物表达载体pCAMBIA1300-Csa680,通过农杆菌介导的遗传转化方法将Csa680基因转化到无苦味黄瓜品种151G中,通过PCR检测获得了四株阳性苗：TG6、TG10、TG15、TG16.基因表达分析表明转基因植株中Csa680基因的表达量均比对照株高。dCAPs实验确定了Csa680基因成功导入到基因组中。提取转基因植株中葫芦素C,经LC-MS检测,在转基因中的植株中均产生了葫芦素C,由此证明,Csa680基因参与葫芦素C的合成。
【作者】马永硕；
【导师】黄三文；杨清；
【作者基本信息】南京农业大学，生物化学与分子生物学，2013，硕士
【关键词】黄瓜；Bi；葫芦素C；酵母表达；烟草瞬时表达；遗传转化；

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