枯草芽孢杆菌BS1 Surfactin高产菌株的选育研究

【摘要】芽孢杆菌能产生多种非核糖体合成的抗菌脂肽,具有很强的广谱抗菌作用,因而在食品、医药、环保、畜牧、石油开采等领域有良好的应用潜力。其中以表面活性素(surfactin)研究最为深入。Surfactin分子量约为1000Da,是目前公认最好的生物表面活性剂,具有良好的乳化和发泡性能。芽孢杆菌发酵产抗菌脂肽surfacitn的产量通常较低,一般低于1.0g/L,无法满足工业生产的需要,因此提高脂肽的产量尤为重要。基因组改组(Genomeshuffling)作为近年来发展起来的微生物育种新技术,是最重要也最为有效的增产手段。本研究以本实验室保藏枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS1为出发菌株,采用多种选育方式提高其产surfactin的能力,以期得到性质稳定的高产菌株,为今后该领域的分子生物学研究及抗菌脂肽.surfactin的工业化生产奠定基础。主要研究结果如下：1.通过理化诱变选育枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS1surfactin高产菌株。分别采用紫外线、60Coγ射线、NTG对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS1进行诱变处理。通过致死率及突变率的统计,确定紫外诱变的条件为：紫外灯功率20w,垂直照射距离15cm,照射时间240s；60Coγ射线辐照剂量300Gy;NTG终浓度0.4mg/mL,37℃保温处理30min。经抑菌实验初筛、摇瓶发酵复筛后获得高产菌株11株,其中菌株UV21surfactin产量较出发菌株提高54%。2.通过复合诱变选育枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS1surfactin高产菌株。先通过单因素诱变确定链霉素、硫酸阿米卡星、青霉素三种抗生素的作用剂量,再将LiCl溶液和种子液1：1混合,30℃保温处理30min,吸取1mL处理液与NTG溶液1：1混合,30℃保温处理30min后涂布在三种抗生素平板上,进行初筛和复筛。通过致死率及突变率的统计,确定三种抗生素的最适诱变浓度为：链霉素2.0mg/L；硫酸阿米卡星40.0U/L；青霉素钠3.0U/L。LiCl溶液浓度30%；NTG终浓度0.4mg/mL。经抑菌实验初筛、摇瓶发酵复筛后获得高产菌株14株,其中菌株PNG27surfactin产量较出发菌株提高63.2%。经过诱变育种共选育出surfactin产量提高40%以的菌株25株,选择其中的UV21、NTG14、SM182、PNG27作为电融合实验的亲本菌株。3.对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS1进行原生质体制备、再生及灭活条件的研究。原生质体制备的最佳条件为：对数期种子液二次转接后培养5h收集菌体,以0.2mg/mL溶菌酶37℃酶解15min,原生质体形成率达98%。优化再生培养基,优化后mol/L丁二酸钠作为培养基的高渗稳定剂,原生质体再生率达到70%。原生质体热灭活和紫外灭活的最佳条件分别为：100℃沸水浴,煮沸20min；紫外灯管30w,照射距离5cm,照射时间20min。4.分别采用化学试剂融合和电融合的方法进行多亲本原生质体递推融合,采用亲本原生质体灭活的方法检出合子。PEG结合Ca2+诱导原生质体融合的最适条件为：pH9.0,37℃条件下,40%PEG6000融合5min,融合率为3.36×10-6,化学试剂融合选用8株诱变菌株作为融合亲本,但未能筛选到稳定融合子。电融合的参数为：脉冲强度9KV/cm,脉冲宽度50us,脉冲个数2个,融合率为8.51×10-5,是化学融合法的25.3倍。电融合选用UV21、NTG14、SM182、PNG27及原始菌株BS1作为融合亲本,经过两轮基因组改组,获得遗传性能稳定的高产突变株F2-174,surfactin产量是原始菌株的2.24倍。
【作者】张莉；
【导师】陆兆新；
【作者基本信息】南京农业大学，发酵工程，2013，硕士
【关键词】枯草芽孢杆菌BS1；抗菌脂肽surfactin；理化诱变；复合诱变育种；基因组改组；

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