猪嗜血支原体阻断ELISA抗体检测试剂盒组装及汉赛巴尔通体间接ELISA方法的建立

【摘要】猪嗜血支原体(Mycoplasmahaemosuis,M.suis)是一种寄生于红细胞表面的病原微生物,临床上慢性感染表现为轻度贫血,消瘦,繁殖机能障碍等,急性病例死亡率高,给养猪业带来了严重的经济损失,但目前血清学诊断技术研究较少,尚无商品化试剂盒。因此,研究猪嗜血支原体的血清诊断试剂盒非常重要。MSG1蛋白是M.suis的一种重要的表面黏附蛋白,具有良好的免疫原性。本研究在实验室已建立的猪嗜血支原体阻断ELISA抗体检测方法的基础上,成功组装试剂盒,并对其性能进行测定。汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae,B.henselae)是目前已知的致病种类最多的巴尔通体,是猫抓病(SCD)的病原体,17-kDa蛋白是汉赛巴尔通体中能够诱导机体产生免疫应答的较少蛋白之一,适合用来建立检测方法。本研究具体内容如下：1.猪嗜血支原体阻断ELISA抗体检测试剂盒各组分的制备与质量检测本研究在实验室已建立的猪嗜血支原体阻断ELISA抗体检测方法的基础上,对试剂盒各个组份进行制备,并进行质量检测。试验结果表明,纯化后获得的重组MSG1蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在45kDa处有明显的表达带,无明显杂带,且抗原性良好,三批蛋白的浓度均为0.5mg/mL以上,能用于试剂盒的制备；包被MSG1蛋白抗原包被板、阴阳性对照血清、酶标抗体、稀释液、洗涤液、显色液、终止液经性状检验、无菌检验及效价检验显示均具有良好的性质,能用于试剂盒的组装。2.猪嗜血支原体阻断ELISA抗体检测试剂盒的组装与保存本研究用保护剂分别处理ELISA方法中的关键试剂,然后组装成试剂盒。进行37℃加速试验及实时实温试验,测定其保存期。结果为：试剂盒各组份在37℃进行加速破坏试验时,均能表现良好的稳定性；将各组份组装成试剂盒后,37℃加速7d基本能保存稳定,实时实温试验证明在4℃保存6个月能基本保持稳定。以上结果表明,该试剂盒具有一定的稳定性,为试剂盒最终开发提供了数据基础。3.猪嗜血支原体血清流行病学调查本研究采用阻断ELISA方法对来自7个省(区)的1492份猪血清进行了检测并对其感染的时间、空间和种群间的分布进行了分析。结果表明：血清抗体总阳性率为17.36%,其中上海地区最高为57.01%,广西地区最低为4.55%,安徽、浙江、江苏、江西和四川分别为28.40%、20.25%、13.93%、7.14%和5.49%。感染时间从6、7月份开始,9月份感染比例达到最高(33.94%),然后开始慢慢下降。种群间分析显示母猪血清阳性率为65.48%,仔猪为4.8%。血清流行病学调查结果显示猪嗜血支原体在我国猪群的感染比较普遍,而且呈现出逐年增加的趋势。4.汉赛巴尔通体17-kDa间接ELISA方法的建立本研究将汉赛巴尔通体17-kDa蛋白基因按大肠杆菌密码子偏嗜性改造后进行全基因人工合成,然后将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-17kDa,导入大肠杆菌BL21感受态细胞中,进行诱导表达并用Ni-NTA纯化试剂进行纯化；纯化后的蛋白应用His单抗进行鉴定。以17-kDa蛋白作为包被抗原及优化ELISA反应条件,建立检测抗汉赛巴尔通体17-kDa蛋白抗体的间接ELISA方法：抗原包被量0.4μg/mL,37℃包被2h后4℃过夜,1%BSA37℃封闭3h,待检血清稀释度1：100后37℃孵育1h,二抗1：15000稀释,37℃作用30min,抗体临界值为OD450≥0.392判为阳性,OD450≤0.3326判为阴性,介于二者之间为可疑。与猪嗜血支原体、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪口蹄疫病毒等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对379份血清样品进行检测,抗体阳性检出率达51.72%。说明该方法可用于汉赛巴尔通体抗体检测和流行病学调查。综上所述,本研究成功组装了猪嗜血支原体阻断ELISA抗体检测试剂盒,通过试验证明该试剂盒在2-8℃保存6个月能基本保持稳定,为该试剂盒的最终产业化提供了实验基础；通过表达汉赛巴尔通体的17-kDa蛋白,成功建立了汉赛巴尔通体17-kDa间接ELISA方法,为研究该病在猪群中的流行情况奠定了物质基础；通过对猪嗜血支原体及汉赛巴尔通体血清流行病学调查,为疾病的防控提供一定数据基础。
【作者】程王琨；
【导师】李玉峰；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪嗜血支原体；试剂盒；汉赛巴尔通体；间接ELISA；流行病学调查；

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