菊芋贮藏致病菌的拮抗菌株筛选及一株海洋假单胞菌拮抗特性的研究

【摘要】菊芋(Helianthustuberosus)是菊科向日葵属多年生草本植物,具有很强的生态适应性,现广泛种植于世界各地。作为一种能源作物,菊芋已成为生物质领域的研究热点。同时它还被用作食品、发酵产乙醇和其他工业产品等。但是,受各种人为和自然因素影响,菊芋仓储期极易发生腐烂,进而成为阻碍菊芋产业规模化发展的制约因素。为了解决菊芋贮藏保鲜问题,本文从生物防治角度筛选分离菊芋贮藏腐烂微生物的拮抗菌株,并对其拮抗机理做了初步研究,为实际生产应用提供一定的理论基础。以自然贮藏条件下的“南芋1号”腐烂菊芋块茎为研究对象,分离鉴定出病原微生物,回接试验验证了致病菌类型；以致病菌为研究对象分离海洋源拮抗微生物,选择拮抗效果明显的JK2菌株作进一步研究,鉴定了其所属菌种；对JK2抗菌代谢产物和在菊芋块茎切片上对致病菌的防治效果做了初步的探究与分析。主要的研究结果如下：1.本研究从腐烂的菊芋块茎组织中分离出了14株病原菌株,其中10株属于真菌,4株属于细菌。通过对它们的形态学观察、生理生化特征分析和分子学鉴定(ITS序歹/16SrRNA序列),与NCBI上的序列进行比对获得最大相似性序列菌株、构建系统发育树综合分析可知,这10株病原真菌分别属于极细链格孢菌Alternariatenuissima(M1、M3、M4和M5),溜曲霉Aspergillustamarii(M2,M10),极细枝孢Cladosporiumtenuissimum(M6),烟曲霉Aspergillusfumigatus(M7),米曲霉Aspergillusoryzae(M8),镰刀菌Fusariumoxysporum(M9);分离到的病原细菌分别属于沙雷氏菌Serratiaplymuthica(B1),假单胞菌Pseudomonassp.(B2),芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus(B3)和芽孢杆菌Bacillussp.(B4).根据科赫原理,对菊芋块茎组织的回接试验发现病原真菌对菊芋块茎的致病率多数在50%以上,而病原细菌未能导致菊芋块茎明显的腐烂迹象,证明导致菊芋腐烂发生的主要致病菌是真菌类病原微生物,因此以这十株病原真菌为防治对象筛选拮抗菌株。2.从三亚采集的海水、海底底泥和红树林底泥等样品中分离到了331株菌株。以致病真菌为抑菌对象,利用平板对峙方法经过初筛和复筛获得29株分别对M1-M10中一个或者多个菊芋腐烂菌有拮抗效果的菌株。其中从海泥(海底底泥和红树林底泥)中共分离227株,占总菌株数量的68.58%,拮抗活性菌21株,占总活性菌株数量的72.41%；从海水样中分离菌株数量不到海泥中的一半,筛选到的有抑菌活性的菌株仅有8株,占其分离比的7.69%。表明分离菌株数量和具活性的菌株数量与样品来源密切相关。其中的拮抗菌株JK2因其对三种菊芋致病真菌(M2、M9和M10)均表现出显著的抑制效果,故对其作进一步的鉴定和拮抗机理的研究。3.对拮抗菌JK2的形态特征分析、生理生化鉴定和16SrRNA序列测定并与NCBI相似性序列比对和构建系统发育树,初步确定菌株JK2为假单胞菌Pseudomonasorientalis.抑菌谱测定结果显示其对玉米大斑病菌、稻瘟菌等植物病原真菌有较强的抑制作用,同时对辣椒疫霉菌和油菜菌核菌也有一定的拮抗效果。表明该菌具有抑制其他农作物病害菌的潜力。不同条件对JK2的生长量测定,发现JK2适宜的盐浓度范围为0-1.5%时,当盐度超过2.0%时生长缓慢。当培养温度范围为20-30℃时,JK2菌生长良好,但在低温下生长缓慢、高温时受到抑制。而当培养基的pH为6.0-9.0时适宜JK2菌生长,表明JK2对酸性和碱性环境敏感。综上结果得出,JK2可能为非严格意义上的海洋微生物,不耐受高温,对酸性和碱性环境敏感。4.为了进一步探究JK2菌的拮抗机理,取共培养对峙实验中JK2菌作用致病真菌的菌丝体部位,在透射电镜下观察发现处理组较对照组的致病真菌发生形变,菌丝细胞壁增厚或者不规则形变,而且细胞器解体甚至消失,细胞壁鞘变形。而对照组菌丝的形态正常,原生质分布均匀,细胞器和内含物无损伤泄露。对JK2菌发酵浓缩液和乙酸乙酯提取胞内代谢物的活性检测表明其并未有明显的抑菌特性,推测JK2菌株可能在液体培养基中不能产生抗菌类物质,在胞内的活性物质可能是小分子信号类物质,其提取方法有待进一步确认。而JK2菌株产挥发性的抗菌物质试验检测结果发现,处理组菌落生长缓慢,菌丝颜色变淡,抑菌率达到48.75%,表明其能产生一定的挥发性抗菌物质。同时JK2在菊芋块茎切片上可直接抑制病原真菌孢子的生长,有一定的生防效果。初步推测JK2是通过分泌挥发性代谢产物或者小分子信号类物质抑制病原菌的生长起到生防作用的。
【作者】金善钊；
【导师】刘兆普；隆小华；
【作者基本信息】南京农业大学，海洋生物学，2013，硕士
【关键词】菊芋；腐烂；致病菌；拮抗菌；海洋假单胞菌；

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