鸭细胞因子克隆表达及ELISA检测方法的建立

【摘要】细胞因子是由细胞分泌的蛋白质,在炎症和免疫应答中发挥着重要作用,主要参与激活和调节其他细胞和组织。目前对哺乳动物细胞因子研究较多,但对禽类细胞因子的作用以及它们相应的蛋白质研究甚少。原因是因为禽类与哺乳动物同源细胞因子的序列相似度很低。随着禽类遗传学和免疫学的新发现,研究者开始探索健康和疾病状态中的细胞因子。樱桃谷鸭作为禽类养殖的重要品种之一,对其细胞因子的研究较少,制约着对其免疫机制的深入研究；同时研究表明,在一些疾病的发生过程中,某些细胞因子的水平会发生明显的变化。因此,本研究对鸭IFN-γ、IL-2、TNF-α基因进行克隆,然后在原核表达系统中进行重组蛋白表达；以此为基础,制备相应的单克隆抗体和多克隆抗体,并初步建立鸭IFN-γ抗原捕获ELISA方法,为研究禽类细胞因子在免疫系统中的作用提供技术支持。1鸭IFN-γ、IL-2、TNF-α克隆、表达及蛋白纯化依据GenBank上发表的绿头鸭IFN-γ基因序列、番鸭IL-2基因序列、鸡TNF-α基因序列分别设计特异性引物,提取樱桃谷鸭脾脏淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR和3′RACE和5’RACE技术,成功扩增到鸭的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因,对鸭的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因进行测序,结果表明本研究通过RT-PCR技术扩增得到的樱桃谷鸭IFN-γ、IL-2(去除信号肽部分)和TNF-α基因的ORF序列大小分别为495bp、363bp、447bp；利用3’RACE和5’RACE技术获得的鸭TNF-a基因序列全长为1049bp。序列分析表明,樱桃谷鸭IFN-γ与绿头鸭IFN-γ的编码区核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%和98.8%,樱桃谷鸭IL-2与番鸭IL-2的编码区(去除信号肽部分)核苷酸和氨基酸同源性分别为98%和94%,樱桃谷鸭TNF-α与鸡TNF-α的编码区核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%和100%。将鸭的IFN-γ、IL-2和TNF-a基因分别克隆至原核表达载体pColdTFDNA中,构建重组表达载体pCold-DuIFNγ、pCold-DuIL2和pCold-DuTNFα,等构建的重组表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温(15℃)诱导表达,表达的重组蛋白经亲和层析进行纯化。SDS-PAGE检测结果表明,这三个基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均以可溶性方式获得表达,融合蛋白相对分子质量分别约为70kDa、65kDa和68kDa。重组蛋白的成功表达、纯化为单克隆抗体和多克隆抗体的制备奠定了基础。2鸭IFN-γ、IL-2、TNF-α的抗体制备1)单克隆抗体制备：将纯化的重组蛋白与佐剂等体积乳化,每隔两周于皮下注射免疫BALB/c小鼠,并在融合前3天腹腔注射无佐剂的重组蛋白。通过间接ELISA筛选出血清效价最高的小鼠进行单抗制备,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经HAT培养基和间接ELISA法筛选,并进行有限稀释法亚克隆,获得稳定性分泌单克隆抗体,其中鸭IFN-7单抗3株、IL-2单抗3株、TNF-a单抗3株。间接ELISA检测结果表明,所获得的阳性杂交瘤细胞制备的小鼠腹水的效价在1：25,600-1：51,200之间。Westernblot检测结果表明,所获得的单克隆抗体具有良好的反应原性。2)多克隆抗体制备：每隔3周于皮下注射免疫新西兰大白兔制备细胞因子抗血清,在最后一次免疫后14天收集兔血清,其效价在1:12,800～1:51,200之间。本研究成功制备了鸭IFN-γ、IL-2、TNF-α的单克隆抗体和多克隆抗体,为下步细胞因子检测方法的建立奠定了基础。3鸭IFN-γ抗原捕获ELISA检测方法的建立将鸭IFN-γ单克隆抗体作为捕获抗体,鸭IFN-γ多克隆抗体作为检测抗体,建立检测鸭IFN-γ的抗原捕获ELISA方法,通过对抗体浓度、封闭液等条件进行优化,确定了单克隆抗体的最佳包被浓度为0.8μg/mL,多克隆抗体的最佳稀释度为1:2,000(浓度为0.8μg/mL),最佳包被时间为4℃过夜,最佳封闭时间为1.5h,最佳封闭液为1%BSA溶液,最佳显色时间为10min,抗原最低检出限为3.9ng/mL。该方法的建立为开发和研制检测鸭IFN-y的抗原捕获ELISA试剂盒奠定了基础。
【作者】刘瑞；
【导师】于圣青；范红结；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】鸭；细胞因子；原核表达；单克隆抗体；抗原捕获ELISA；

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