猪源呼肠孤病毒分子流行病学调查及分离株的鉴定

【摘要】2011年,我国猪群中暴发一种以腹泻等为主要症状的传染病。为了研究“猪腹泻病”中主要病毒性病原在国内的流行情况,本研究对猪源哺乳动物呼肠孤病毒进行了分子流行病学调查；分析了MRV国内流行株与国内外其它毒株间的遗传演化关系。在对病毒分离鉴定方法认识的基础上,利用Vero细胞分离到一株猪源1型呼肠孤病毒；构建了分离株的全长cDNA克隆。本研究为我国猪群中主要病毒病原的分子流行病学特征提供科学依据,同时也丰富了猪源MRV流行病学研究资源。本研究具体内容如下：1中国部分地区猪群中哺乳动物呼肠孤病毒分子流行病学调查为了研究中国猪群中哺乳动物呼肠孤病毒(MammalianReovirus,MRV)的分子流行病学,本试验用巢式RT-PCR检测2010年1月到2012年12月送检的不同猪场病料,并对其中45份阳性病料的核酸进行浓缩后用根据S1基因设计的型特异性的引物进行RT-PCR,同时将扩增产物纯化并克隆至T载体经测序后进行进化分析。进化分析结果表明这些毒株分属血清1、2、3型。3型毒株为优势流行毒株,流行范围覆盖大陆绝大部分地区。这些结果丰富了国内MRV基因变异情况的数据,将为新的诊断方法的建立、流行病学监测以及有效的防控措施制定提供理论基础。2一株猪源1型呼肠孤病毒的分离及鉴定通过在细胞培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离、纯化并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生细胞病变(CPE),以细胞颗粒增多、肿胀、漂落等细胞病变为主要特征的病毒,经病毒纯化,通过电镜观察、核酸提取、RNA电泳、RT-PCR、各病毒基因扩增、克隆测序、S1基因的同源性分析和核苷酸系统发育进化树分析等方法对分离株进行了病毒学鉴定,证明为猪源1型呼肠孤病毒,定名为SHR-A株。此为国内首次报道从猪体内分离到的血清1型的呼肠孤病毒。进一步分析发现,SHR-A的S1基因全长为1465bp,其3’-UTR为3型,其余部分则为1型,说明其S1基因是1型和3型的嵌合体,表明哺乳动物呼肠孤作为RNA病毒,基因重组可能是其除基因突变和基因重排以外的第三种病毒变异进化的重要方式。3呼肠孤病毒SHR-A株全长cDNA克隆的构建及序列分析对猪源SHR-A株全基因序列测序,为我国猪源呼肠孤病毒病原学研究奠定基础。采用RT-PCR方法分10个片段扩增SHR-A株全基因序列；病毒5’-末端与3’-末端序列采用RACE方法扩增,扩增得到的各片段克隆测序。将测序得到的个片段序列采用Seqman软件拼接后,得到了SHR-A分离株全长序列,其总长度为23608nt,包括4个小片段(S1-S4)、三个中等大小片段(M1-M3)以及三个大片段(L1-L3)。成功获得SHR-A株全基因序列,丰富了猪源MRV流行病学研究资源。4呼肠孤病毒1型S1、S4基因在sf9昆虫细胞中的表达为研究1型呼肠孤病毒σ1和σ3蛋白功能和建立呼肠孤病毒1型血清学诊断方法,建立了分离株S1、S4两个基因的杆状病毒-Sf9昆虫细胞表达系统。采用PCR方法扩增该病毒的全长为1465bp的S1基因和1196bp的S4基因,将其分别插入杆状病毒转座载体pBAC-1中,构建的重组质粒pBACS1和pBAC～S4,再分别和BacMagic-3DNA共转染sf9昆虫细胞,共培养10日后获得杆状病毒重组病毒rB-S1和rB-S4。免疫荧光法(IFA)和westemblotting检测结果表明,S1基因和S4在Sf9昆虫细胞中表达出约为50kD和41kD的重组蛋白,且具有免疫原性。为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。
【作者】何小明；
【导师】丁铲；姚火春；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪源呼肠孤病毒分子流行病学调查；呼肠孤病毒1型分离鉴定；S1基因；S4基因；杆状病毒表达系统；

【参考文献】
[1]柳登.供应链中知识共享框架的研究[J].物流科技,2005,10:52-54.
[2]魏淑丽.承德市中小学教师在职培训现状调查及对策研究[D].河北师范大学,教育管理,2014,硕士.
[3]孙玉生.军区科技论文管理系统的设计与安全性研究[D].东北大学,计算机技术,2011,硕士.
[4]黄茜.软式内镜清洗刷对生物膜清除效果的调查与实验研究[D].南方医科大学,护理学,2012,硕士.
[5]邢洁,陈陈,王杰.区间不确定信息下的小干扰稳定分析方法[J].电力系统自动化,2010,06:12-16.
[6]蔡斯嘉.提案式政治参与研究[D].南昌大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[7]毛剑飞,毛飞飞,张杰,王刚.一种H.264亚像素全搜索的改进算法[J].小型微型计算机系统,2013,04:902-905.
[8]范海亮.基于PLC的模糊PID复合控制在热泵干燥控制系统中的应用[D].南京农业大学,农业机械化工程,2012,硕士.
[9]武惠珍.内蒙古妇女儿童中心发展战略[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[10]曹晓琴.姬塬罗庞塬长6低渗储层关键参数评价[D].西北大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[11]马文聪.中药组方痛风一号对痛风的治疗作用及机制的初步研究[D].广州医科大学,药理学,2014,硕士.
[12]孙敏强,张涛,王春燕,王庚超.聚(1,5-二氨基蒽醌)/磺化石墨烯纳米复合材料的合成及其电化学储能研究[A].中国化学会高分子学科委员会.2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题J：高分子复合体系[C].中国化学会高分子学科委员会:,2013:1.
[13]王华锋.电磁诱导葛根素结晶纯化技术研究[D].合肥工业大学,农产品加工及贮藏工程,2004,硕士.
[14]丁百川.矿井瓦斯抽放管网系统的优化管理技术[D].辽宁工程技术大学,安全技术及工程,2004,硕士.
[15]任雁铭,操丰梅,唐喜,王治民,余斌,刘炬.智能电网的通信技术标准化建议[J].电力系统自动化,2011,03:1-4+61.
[16]张向阳.Z-pin增强苯并噁嗪层合板制备及力学性能研究[D].南京航空航天大学,材料加工工程,2013,硕士.
[17]段素萍.银纳米线的制备及其在导电胶中的应用[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[18]徐铁伟,张丰收,刘向宏,李金山.Ti-15Mo-3Al-2.7Nb-0.2Si钛合金强化效应与机理研究[J].热加工工艺,2014,20:56-59.
[19]崔若飞.基于ARM和GPRS智能家居监控系统的设计与研究[D].北京交通大学,2009.
[20]李晓婷.新城疫病毒F蛋白对其致病性影响的研究[D].山东师范大学,微生物学,2013,硕士.
[21]李冰,汤嫣,张梓轩.主流媒体国际传播的新特点——以新华社Twitter两会报道为例[J].新闻与写作,2015,05:98-101.
[22]王焕磊.三维纳米结构炭基材料的能量存储研究[A].中国化学会.第十三届固态化学与无机合成学术会议论文摘要集[C].中国化学会:,2014:1.
[23]陶春晖.糖安液对糖尿病胃轻瘫大鼠血浆内皮素及一氧化氮的影响[D].湖北中医学院,中医内科学,2004,硕士.
[24]马少琦.我国税收行政法律责任研究[D].西北大学,经济法学,2014,硕士.
[25]范帆.Hadoop中基于优先级的调度算法研究[D].复旦大学,软件与理论,2012,硕士.
[26]桂卫华,阳春华,李勇刚,贺建军,尹林子.基于数据驱动的铜闪速熔炼过程操作模式优化及应用[J].自动化学报,2009,06:717-724.
[27]田晓麟.30Cr3钢薄壁管状工件形变热处理工艺的研究[D].上海交通大学,材料学,2013,硕士.
[28]马中高,张国保,孙成龙.多方位速度和AVOA同步分析[J].石油地球物理勘探,2009,S1:135-137+144+168+1.
[29]原林林.涉外消费者合同的法律适用研究[D].郑州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[30]杨俊玲.苹果花叶病毒（ApMV）和李属矮缩病毒（PDV）RT-PCR检测体系的研究[D].内蒙古农业大学,果树学,2004,硕士.
[31]张良义.谈轧机测速机转速、速比选择与安装问题[J].冶金自动化,1996,06:44-46.
[32]谢秀文.科尔沁蒙古传统整骨在当代的实践[D].内蒙古师范大学,人类学,2013,硕士.
[33]高艺.智能型电动机综合保护器的研究[D].沈阳工业大学,电气工程,2004,硕士.
[34]石瑞红.器官型海马脑片水平抑制蛋白酶体的活性对tau蛋白代谢的影响及其机制研究[D].华中师范大学,动物学,2012,硕士.
[35]王银洁.ZNF139、Survivin与Bcl-2在胃癌及转移淋巴结中的异质性表达[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[36]刘浩.益气活血改善慢性阻塞性肺疾病轻中度稳定期生活质量的临床研究[D].辽宁中医药大学,中医内科学（专业学位）,2012,硕士.
[37]张誉.大型丙烯绘画创作研究[D].沈阳师范大学,美术,2014,硕士.
[38]唐俊虎,王文志.浅析人保公司信息技术资源的开发与利用[J].金融电子化,2002,10:24-26.
[39]张济平.知识管理是高科技企业的金钥匙[J].科技·人才·市场,2003,04:62-64.
[40]路平山.土地生态系统安全关键地段识别研究[D].南京农业大学,土地资源管理,2011,硕士.
[41]刘连凤.Translating Metaphors in Economic News: a Conceptual Metaphor Theory Account[D].西安外国语大学,MTI翻译,2014,硕士.
[42]卢军,付建华,陆军,王毅青,倪伟健,杨鹏.互动话题(一)[J].机电信息.2007(26)
[43]刘瑞琪.血清外泌体分离鉴定及其内含物与帕金森病关联研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[44]闫崇强.交叉V形吸热板-V形底板空气集热器性能特性研究[D].云南师范大学,农业生物环境与能源工程,2013,硕士.
[45]宋二红.过渡金属掺杂石墨烯表面若干催化过程的第一原理研究[D].吉林大学,2013.
[46]谭林.世界男子自由体操和单杠的发展趋势研究[D].西北师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[47]牛晓蕾.急性胰腺炎患者内毒素血症与小肠细菌过生长的相关性研究[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[48]谭巧巧.服务接触对顾客网购满意度的影响研究[D].哈尔滨工业大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[49]杨凯.苏州大学体育学院08至11级体育教育专业学生体育加试成绩的分析[D].苏州大学,体育教学,2012,硕士.
[50]万书婷.《博异志》研究[D].安徽大学,中国古代文学,2014,硕士.