猪嗜血支原体MSG1蛋白B细胞表位的解析及双抗体夹心ELISA方法的建立

【摘要】猪嗜血支原体(Mycoplasmassuis/M.suis)又称猪附红细胞体(porcineeperythrozoon/PE),是传染性贫血病(Infectiousanemia)的病原体,危害全球养猪业。目前猪嗜血支原体被鉴定出至少有8种病原蛋白,其中MSG1蛋白黏附红细胞和糖酵解的功能,被认为是重要的病原蛋白。本研究成功制备5株抗MSG1蛋白的单克隆抗体,并鉴定获得的3个表位(251-255aa,268-274aa,291-299aa).为猪嗜血支原体表位疫苗研究奠定重要基础。本研究同时还利用制备的单克隆抗体建立了MSG1蛋白双抗体夹心ELISA方法,有望为建立猪嗜血支原体的快速诊断方法奠定基础。研究内容主要分为以下3部分：1.猪嗜血支原体MSG1蛋白单克隆抗体的制备以实验室保存的含猪嗜血支原体msg1基因的重组质粒pBAD/His-msgl转化至宿主菌Top10中,并诱导表达获得重组MSG1蛋白。将纯化的重组蛋白MSG1与等量的弗氏佐剂混合乳化,皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。取抗体检测阳性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出5株能稳定分泌抗猪嗜血支原体MSG1蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为：1C10、2D8、2F10、4G10和10E9。Westernblot结果显示5株单克隆抗体均能够特异性地识别重组MSG1蛋白。间接免疫荧光试验(IFA)结果证明5株单克隆抗体均能够与天然猪嗜血支原体发生特异性反应。抗猪嗜血支原体MSG1蛋白单克隆抗体的制备成功,为免疫诊断试剂盒制备和抗原表位的研究奠定了基础。2.猪嗜血支原体MSG1蛋白B细胞表位的解析为了精确定位猪嗜血支原体MSG1蛋白单克隆抗体识别的B细胞表位,以重组质粒pBAD/His-msgl为模板,设计扩增23个截短msg1基因片段,克隆至pET-32a载体,利用大肠杆菌原核表达系统构建表达这23个重组截短的蛋白。通过间接ELISA和Westernblot方法精确定位四株单克隆抗体识别的表位,结果显示：单抗4G10和10E9能够识别的位点是I(268)KDGENE(274),单抗1C10识别的位点为D(291)THGSVF(297),单抗2F10识别的位点为I(251)CLKT(255),三个表位均为线性表位。以上结果丰富了猪嗜血支原体MSG1抗原表位图谱,为进一步研究MSG1蛋白的相关功能奠定一定的基础。3.猪嗜血支原体MSGl蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立为建立方便快捷的猪嗜血支原体检测方法,本研究以原核表达的MSG1蛋白制备的单克隆抗体2F10作为包被抗体,酶标单克隆抗体1A7-HRP为检测抗体,建立MSG1蛋白双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为：抗MSG1蛋白MAb2F10的包被浓度为4μg/mL,1A7-HRP的稀释度为1：500。该ELISA方法对猪链球菌和副猪嗜血杆菌均无交叉反应；敏感度可达0.0625μg/mL;其重复性变异系数小于10%。本实验建立的MSGl双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、方便等优点,可以作为检测嗜血支原体的基础。
【作者】常晨；
【导师】李玉峰；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪嗜血支原体；MSG1蛋白；B细胞表位；双抗体夹心ELISA；

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