嗜水气单胞菌噬菌体的生物学特性及基因组学研究

【摘要】嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是一种重要的人畜共患病病原,其致病菌株能引起动物暴发性出血病和人类肠胃炎等疾病,对水产养殖业以及动物和人类的健康构成威胁。但现今随着抗生素的大量使用,许多菌株出现了多重耐药性,这给该病的防控带来一定的挑战。噬菌体作为一种细菌病毒,具有高效裂解细菌的特性。因此研究嗜水气单胞菌噬菌体对控制此类细菌感染具有重要的意义。本试验从地下水和污染河流水样中分离出两株嗜水气单胞菌噬菌体,分别命名为CC2和9-1,并从形态学、生理和分子水平对其特性进行研究。结果发现两株噬菌体均具有六边形长头部和收缩性尾部,属于肌尾病毒科。CC2能裂解25株嗜水气单胞菌中的6株,在控制嗜水气单胞菌的感染上具有一定的应用价值。9-1的宿主范围遍布至少4种气单胞菌。一步生长曲线表明CC2潜伏期为20min,生长期140min,科均感染度为303PFU/cell;噬菌体9-1的潜伏期为25min,生长期105min,平均感染度为177PFU/cell.两株噬菌体对高温和低pH均较为敏感。为了全面了解噬菌体CC2的遗传背景,利用甘油梯度离心纯化噬菌体CC2并提取其基因组DNA,采用454高通量测序法完成基因组测序。测序结果表明噬菌体CC2基因组长231,743bp,碱基组成为：A=30.05%[69645]；G=17.82%[41297]；C=21.00%[48668];T=31.13%[72133];A+T=61.18%,G+C=38.82%。采用Glimmer3.0和Prodigal软件预测出噬菌体CC2的基因组可能存在427个开放阅读框（Openreadingframe,ORF）。通过BLASTP和RPSBLAST工具在各大核酸和蛋白数据库中的检索,发现108个ORFs的基因产物具有预测的功能。这些ORFs分布于CC2基因组的3个相应模块中：DNA代谢与复制模块、DNA组装与结构形成模块和细胞裂解模块。全基因组序列比对表明,噬菌体CC2和杀鲑气单胞菌噬菌体65具有较高的同源性,为64%,而与嗜水气单胞菌噬菌体Aehl的同源性只有12%。使用MEGA4.1构建三个保守蛋白的系统发生树,结果表明噬菌体CC2的末端酶、尾管蛋白和DNA聚合酶与气单胞菌噬菌体蛋白亲缘关系最近。为了研究噬菌体CC2溶菌酶LysC的溶菌效果,在基因组测序的基础上,通过建立大肠杆菌原核表达系统的方法获得纯化的且具有溶菌活性的嗜水气单胞菌噬菌体溶菌酶LysC。具体方法为：设计针对lysC基因的引物,利用噬菌体CC2原液进行PCR扩增,获得编码LysC的DNA。将该DNA片段插入pET-28a（+）载体,构建出重组表达载体pET-LysC,并转化入大肠杆菌BL21细胞中。通过测定重组载体序列并与原始lysC基因序列比对,确定所插基因为噬菌体溶菌酶基因。重组菌株用IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析,18.4kD处有目的条带。表达产物经纯化后,利用滤纸片法检测发现LysC具有裂菌活性,比浊法测定表明终浓度为200μg/mL的LysC能使敏感菌OD600降低约50%。
【作者】沈婵娟；
【导师】刘永杰；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】嗜水气单胞菌；噬菌体；生物学特性；基因组测序；溶菌酶；LysC；

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